Bt毒蛋白cryIAb-Ac基因在畢赤酵母GS115中的表達研究.pdf

1、本研究將Bt毒蛋白基因CrylAb/Ac克隆到畢赤酵母GS115中，構(gòu)建帶有crylAb/Ac基因的工程菌。 運用primer5軟件設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶Not I和．EcoR I酶切位點的引物，通過PCR的方法擴增crylAb/Ac基因帶編碼毒蛋白3個結(jié)構(gòu)域的1.8kb序列，并對這兩條基因片段進行了亞克隆，構(gòu)建出載體pMD-crylAb/Ac。將建載體pMD-cryIAb/Ac進行序列測定，其中cryIAb基因有2個堿基發(fā)生改變

2、，編碼一個氨基酸發(fā)生改變，但不編碼毒蛋白的活性中心；cryIAc基因與原基因序列相同。選擇畢赤酵母表達載體pPIC9K，利用限制性內(nèi)切酶Not I和．EcoR I雙酶切pMD-crylAb/Ac和表達載體pPIC9K，再通過T4連接酶連接，構(gòu)建出分泌型重組載體pPIC9K-CrylAb/Ac。用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。PCR鑒定證明cryIAb/Ac基因已成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中。 在甲醇的誘導(dǎo)

3、下，CryIAb/Ac毒蛋白都得到了有效分泌和表達。通過SDS-PAGE凝膠電泳分析，cryIAb/Ac基因表達的重組蛋白都在70kDa左右。當(dāng)誘導(dǎo)pH值為6.6時，搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵72小時的蛋白表達量都達到最大。生物測定結(jié)果表明，CryIAb/Ac毒蛋白對甜菜夜蛾和二化螟都有較強的毒殺作用。CryIAc毒蛋白對甜菜夜蛾的LC<,50>為0.2μg/ml，CryIAb毒蛋白對甜菜夜蛾的LD<,50>為0.7μg/ml，CryIAb毒蛋白對二