Bt毒蛋白cryIAb-Ac基因在畢赤酵母GS115中的表達(dá)研究.pdf

1、本研究將Bt毒蛋白基因CrylAb/Ac克隆到畢赤酵母GS115中，構(gòu)建帶有crylAb/Ac基因的工程菌。 運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶Not I和．EcoR I酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR的方法擴(kuò)增crylAb/Ac基因帶編碼毒蛋白3個(gè)結(jié)構(gòu)域的1.8kb序列，并對(duì)這兩條基因片段進(jìn)行了亞克隆，構(gòu)建出載體pMD-crylAb/Ac。將建載體pMD-cryIAb/Ac進(jìn)行序列測(cè)定，其中cryIAb基因有2個(gè)堿基發(fā)生改變

2、，編碼一個(gè)氨基酸發(fā)生改變，但不編碼毒蛋白的活性中心；cryIAc基因與原基因序列相同。選擇畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，利用限制性內(nèi)切酶Not I和．EcoR I雙酶切pMD-crylAb/Ac和表達(dá)載體pPIC9K，再通過T4連接酶連接，構(gòu)建出分泌型重組載體pPIC9K-CrylAb/Ac。用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。PCR鑒定證明cryIAb/Ac基因已成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中。 在甲醇的誘導(dǎo)

3、下，CryIAb/Ac毒蛋白都得到了有效分泌和表達(dá)。通過SDS-PAGE凝膠電泳分析，cryIAb/Ac基因表達(dá)的重組蛋白都在70kDa左右。當(dāng)誘導(dǎo)pH值為6.6時(shí)，搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵72小時(shí)的蛋白表達(dá)量都達(dá)到最大。生物測(cè)定結(jié)果表明，CryIAb/Ac毒蛋白對(duì)甜菜夜蛾和二化螟都有較強(qiáng)的毒殺作用。CryIAc毒蛋白對(duì)甜菜夜蛾的LC<,50>為0.2μg/ml，CryIAb毒蛋白對(duì)甜菜夜蛾的LD<,50>為0.7μg/ml，CryIAb毒蛋白對(duì)二