金屬螯合效應(yīng)在高效液相色譜分析中的影響.pdf

1、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）在醫(yī)藥領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用，其定性定量的準(zhǔn)確性，對(duì)于藥物研發(fā)、質(zhì)量控制、指紋圖譜等方面的工作有著極其重要的意義。然而，HPLC分析中的金屬螯合效應(yīng)可造成峰形嚴(yán)重拖尾，甚至形成新的雜峰，改變色譜峰形、積分面積，干擾其重現(xiàn)性，進(jìn)而降低圖譜的定性定量的準(zhǔn)確度和可信度。已有報(bào)道從概念和基本現(xiàn)象上闡述HPLC中的金屬螯合效應(yīng)，但未見金屬量與色

2、譜峰形間的量效關(guān)系研究。本文力圖從簡(jiǎn)單的模式化合物入手，以向樣品溶液中定量添加金屬離子的方式模擬樣品在分析前和進(jìn)入色譜柱時(shí)接觸金屬離子后發(fā)生反應(yīng)，通過設(shè)計(jì)一系列色譜學(xué)實(shí)驗(yàn)考察由此產(chǎn)生的色譜行為變化。建立了以峰對(duì)稱度為指標(biāo)考察峰形變化的量化評(píng)價(jià)方法，旨在考察 HPLC體系中金屬離子的存在對(duì)色譜峰的影響程度、可能環(huán)境等問題，進(jìn)而探索可能的預(yù)防和糾正辦法，為提高HPLC應(yīng)用水平提供重要參考。
　　本研究選擇檸檬酸和2,2’-聯(lián)吡啶作為模

3、式化合物，因檸檬酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、螯合位點(diǎn)明確，且是植物藥物中常見的有機(jī)酸，具有代表性；而2,2’-聯(lián)吡啶能夠象征性地說明化合物在堿性條件下受金屬離子影響的情形，且能與結(jié)構(gòu)相似但沒有螯合性的4,4’-聯(lián)吡啶平行進(jìn)樣，便于比較。主要研究?jī)?nèi)容為：
　　(1)根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)而運(yùn)用序貫優(yōu)化法，建立樣品的最佳色譜分析條件；
　　(2)構(gòu)建以色譜峰對(duì)稱度為主要指標(biāo)的評(píng)價(jià)方式，量化評(píng)價(jià)檸檬酸和2,2’-聯(lián)吡啶樣品溶液中定量添加不同種類和數(shù)量的金屬

4、離子后色譜峰的變化情況，并繪制變化趨勢(shì)圖；
　　(3)變更流動(dòng)相pH值后進(jìn)行考察：在酸性流動(dòng)相下，檸檬酸樣品中混入不同種類和數(shù)量的金屬離子后進(jìn)行分析；在堿性流動(dòng)相下，2,2’-聯(lián)吡啶樣品中混入不同種類和數(shù)量的金屬離子后進(jìn)樣分析；4,4’-聯(lián)吡啶樣品相同處理后平行進(jìn)樣，以作對(duì)照；
　　(4)探討 EDTA（取其二鈉鹽形式，下同）加入到樣品溶液中和作為流動(dòng)相使用時(shí)，對(duì)于待測(cè)樣品的保護(hù)作用。
　　通過實(shí)驗(yàn)，得到以下結(jié)論：

5、r>　　(1)金屬離子對(duì)螯合性化合物的HPLC分析的影響
　　①對(duì)于具有螯合性質(zhì)的樣品，金屬離子能夠?qū)悠返纳V峰形產(chǎn)生顯著的影響，造成峰的對(duì)稱度顯著變化，按偏離1.0的方向升高或降低（即拖尾），乃至產(chǎn)生一至若干個(gè)雜峰，且金屬離子的影響效應(yīng)隨其在溶液中所占比例增大而增加；樣品溶液中存在部分有機(jī)溶劑對(duì)樣品與金屬離子的相互作用基本沒有影響；
　?、诨衔锱c金屬的螯合活性和反應(yīng)速率不同，有可能對(duì)圖譜的重現(xiàn)性造成影響。在檸檬酸樣品與

6、金屬離子接觸的至少一小時(shí)內(nèi)，體系處于不穩(wěn)定狀態(tài)，螯合反應(yīng)的發(fā)生及反應(yīng)程度難以預(yù)計(jì)，且能產(chǎn)生不可重現(xiàn)的雜峰，24h后溶液體系基本穩(wěn)定，圖譜能夠再現(xiàn)并顯示出一定的規(guī)律性；而與金屬離子混合后的2,2’-聯(lián)吡啶溶液，初次進(jìn)樣即出現(xiàn)明顯的規(guī)律性，24h和48h后重復(fù)進(jìn)樣，再現(xiàn)性良好，表明2,2’-聯(lián)吡啶與金屬離子間反應(yīng)迅速且產(chǎn)物穩(wěn)定。
　?、塾捎谂c化合物的螯合活性及螯合產(chǎn)物穩(wěn)定性的不同，不同種金屬離子的影響效應(yīng)間存在差異，對(duì)檸檬酸為：FeⅢ

7、＞FeⅡ＞AlⅢ＞ZnⅡ≈CaⅡ；對(duì)于2,2’-聯(lián)吡啶則是：pH7.0流動(dòng)相下FeⅡ＞FeⅢ＞AlⅢ＞CaⅡ＞ZnⅡ；pH8.0流動(dòng)相下FeⅡ＞FeⅢ＞CaⅡ＞ZnⅡ＞AlⅢ。
　?、芰鲃?dòng)相的pH值可顯著改變待測(cè)樣品與金屬離子間的相互作用程度。酸性流動(dòng)相條件能夠抑制檸檬酸與金屬離子的螯合效應(yīng)，在 pH2.0流動(dòng)相下，各金屬離子對(duì)峰形的影響均被減弱；堿性流動(dòng)相條件能夠提高2,2’-聯(lián)吡啶與金屬離子的反應(yīng)程度，在 pH9.0流動(dòng)相下，

8、少量金屬離子即可對(duì)峰形產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。這與化學(xué)中酸性環(huán)境抑制螯合反應(yīng)，堿性環(huán)境促進(jìn)螯合反應(yīng)的結(jié)論是一致的。
　　(2)EDTA作為保護(hù)試劑的效果
　?、貳DTA加入檸檬酸溶液不能有效避免樣品與金屬離子的相互作用，反而使樣品分析復(fù)雜化；加入2,2’-聯(lián)吡啶溶液中，則能夠較好地保護(hù)待測(cè)樣品，使色譜峰形在相當(dāng)程度上保持穩(wěn)定。
　?、谝?EDTA溶液作為水相，與甲醇組成流動(dòng)相分析檸檬酸，出現(xiàn)寬峰、峰高大幅降低、基線抬升等現(xiàn)象，不

9、能取得預(yù)期效果。分析認(rèn)為這與 EDTA和檸檬酸在水溶液中同為有機(jī)酸陰離子，結(jié)構(gòu)上有相似性有關(guān)。而將其用于分析2,2’-聯(lián)吡啶，從結(jié)果看色譜峰形良好、對(duì)稱度保持相對(duì)穩(wěn)定，受金屬離子的影響大大減小。
　　③結(jié)合變化幅度和圖譜表現(xiàn)而言，以 EDTA溶液作為流動(dòng)相用于螯合性物質(zhì)的色譜分離，效果優(yōu)于將EDTA加入樣品溶液。
　　④綜上，EDTA作為HPLC分析中的螯合保護(hù)劑并非對(duì)所有樣品都有效，有時(shí)反而得不償失，必須根據(jù)具體情況采用。