金屬螯合效應在高效液相色譜分析中的影響.pdf

1、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）在醫(yī)藥領域有著極其廣泛的應用，其定性定量的準確性，對于藥物研發(fā)、質(zhì)量控制、指紋圖譜等方面的工作有著極其重要的意義。然而，HPLC分析中的金屬螯合效應可造成峰形嚴重拖尾，甚至形成新的雜峰，改變色譜峰形、積分面積，干擾其重現(xiàn)性，進而降低圖譜的定性定量的準確度和可信度。已有報道從概念和基本現(xiàn)象上闡述HPLC中的金屬螯合效應，但未見金屬量與色

2、譜峰形間的量效關(guān)系研究。本文力圖從簡單的模式化合物入手，以向樣品溶液中定量添加金屬離子的方式模擬樣品在分析前和進入色譜柱時接觸金屬離子后發(fā)生反應，通過設計一系列色譜學實驗考察由此產(chǎn)生的色譜行為變化。建立了以峰對稱度為指標考察峰形變化的量化評價方法，旨在考察 HPLC體系中金屬離子的存在對色譜峰的影響程度、可能環(huán)境等問題，進而探索可能的預防和糾正辦法，為提高HPLC應用水平提供重要參考。
　　本研究選擇檸檬酸和2,2’-聯(lián)吡啶作為模

3、式化合物，因檸檬酸結(jié)構(gòu)簡單、螯合位點明確，且是植物藥物中常見的有機酸，具有代表性；而2,2’-聯(lián)吡啶能夠象征性地說明化合物在堿性條件下受金屬離子影響的情形，且能與結(jié)構(gòu)相似但沒有螯合性的4,4’-聯(lián)吡啶平行進樣，便于比較。主要研究內(nèi)容為：
　　(1)根據(jù)實際經(jīng)驗而運用序貫優(yōu)化法，建立樣品的最佳色譜分析條件；
　　(2)構(gòu)建以色譜峰對稱度為主要指標的評價方式，量化評價檸檬酸和2,2’-聯(lián)吡啶樣品溶液中定量添加不同種類和數(shù)量的金屬

4、離子后色譜峰的變化情況，并繪制變化趨勢圖；
　　(3)變更流動相pH值后進行考察：在酸性流動相下，檸檬酸樣品中混入不同種類和數(shù)量的金屬離子后進行分析；在堿性流動相下，2,2’-聯(lián)吡啶樣品中混入不同種類和數(shù)量的金屬離子后進樣分析；4,4’-聯(lián)吡啶樣品相同處理后平行進樣，以作對照；
　　(4)探討 EDTA（取其二鈉鹽形式，下同）加入到樣品溶液中和作為流動相使用時，對于待測樣品的保護作用。
　　通過實驗，得到以下結(jié)論：

5、r>　　(1)金屬離子對螯合性化合物的HPLC分析的影響
　?、賹τ诰哂序闲再|(zhì)的樣品，金屬離子能夠?qū)悠返纳V峰形產(chǎn)生顯著的影響，造成峰的對稱度顯著變化，按偏離1.0的方向升高或降低（即拖尾），乃至產(chǎn)生一至若干個雜峰，且金屬離子的影響效應隨其在溶液中所占比例增大而增加；樣品溶液中存在部分有機溶劑對樣品與金屬離子的相互作用基本沒有影響；
　?、诨衔锱c金屬的螯合活性和反應速率不同，有可能對圖譜的重現(xiàn)性造成影響。在檸檬酸樣品與

6、金屬離子接觸的至少一小時內(nèi)，體系處于不穩(wěn)定狀態(tài)，螯合反應的發(fā)生及反應程度難以預計，且能產(chǎn)生不可重現(xiàn)的雜峰，24h后溶液體系基本穩(wěn)定，圖譜能夠再現(xiàn)并顯示出一定的規(guī)律性；而與金屬離子混合后的2,2’-聯(lián)吡啶溶液，初次進樣即出現(xiàn)明顯的規(guī)律性，24h和48h后重復進樣，再現(xiàn)性良好，表明2,2’-聯(lián)吡啶與金屬離子間反應迅速且產(chǎn)物穩(wěn)定。
　　③由于與化合物的螯合活性及螯合產(chǎn)物穩(wěn)定性的不同，不同種金屬離子的影響效應間存在差異，對檸檬酸為：FeⅢ

7、＞FeⅡ＞AlⅢ＞ZnⅡ≈CaⅡ；對于2,2’-聯(lián)吡啶則是：pH7.0流動相下FeⅡ＞FeⅢ＞AlⅢ＞CaⅡ＞ZnⅡ；pH8.0流動相下FeⅡ＞FeⅢ＞CaⅡ＞ZnⅡ＞AlⅢ。
　?、芰鲃酉嗟膒H值可顯著改變待測樣品與金屬離子間的相互作用程度。酸性流動相條件能夠抑制檸檬酸與金屬離子的螯合效應，在 pH2.0流動相下，各金屬離子對峰形的影響均被減弱；堿性流動相條件能夠提高2,2’-聯(lián)吡啶與金屬離子的反應程度，在 pH9.0流動相下，

8、少量金屬離子即可對峰形產(chǎn)生嚴重干擾。這與化學中酸性環(huán)境抑制螯合反應，堿性環(huán)境促進螯合反應的結(jié)論是一致的。
　　(2)EDTA作為保護試劑的效果
　?、貳DTA加入檸檬酸溶液不能有效避免樣品與金屬離子的相互作用，反而使樣品分析復雜化；加入2,2’-聯(lián)吡啶溶液中，則能夠較好地保護待測樣品，使色譜峰形在相當程度上保持穩(wěn)定。
　?、谝?EDTA溶液作為水相，與甲醇組成流動相分析檸檬酸，出現(xiàn)寬峰、峰高大幅降低、基線抬升等現(xiàn)象，不

9、能取得預期效果。分析認為這與 EDTA和檸檬酸在水溶液中同為有機酸陰離子，結(jié)構(gòu)上有相似性有關(guān)。而將其用于分析2,2’-聯(lián)吡啶，從結(jié)果看色譜峰形良好、對稱度保持相對穩(wěn)定，受金屬離子的影響大大減小。
　?、劢Y(jié)合變化幅度和圖譜表現(xiàn)而言，以 EDTA溶液作為流動相用于螯合性物質(zhì)的色譜分離，效果優(yōu)于將EDTA加入樣品溶液。
　?、芫C上，EDTA作為HPLC分析中的螯合保護劑并非對所有樣品都有效，有時反而得不償失，必須根據(jù)具體情況采用。