Cys突變對于GcGAST蛋白抗氧化活性的影響.pdf

1、赤霉酸誘導的富含半胱氨酸蛋白是一類在植物多種生理過程當中都發(fā)揮著重要作用的蛋白。2006、2010年 Eigoda等人報道該蛋白家族成員在體內(nèi)具有抗氧化活性,但其詳細的抗氧化機理尚不清楚。由于這些蛋白C-末端含有12個保守的半胱氨酸殘基,而Cys除了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)外,還可能具有抗氧化活性,因此本論文擬探討這些Cys殘基對于GcGAST蛋白抗氧化功能的影響并研究其包涵體的二級結(jié)構(gòu)。
　　方法:在重組質(zhì)粒構(gòu)建方面,選擇pET-28(a)作為

2、原核表達載體。在此基礎上,采用PCR定點突變技術,將重組質(zhì)粒作為模板進行突變。這樣我們可以得到十二個半胱氨酸單突變體。選擇大腸桿菌BL21(DE3)作為原核表達載體,采用IPTG誘導表達。在此基礎上,分別選擇全細胞及包涵體,檢測它們清除H2O2的能力。此外,還運用FTIR手段、吸收光譜研究GcGASA包涵體的二級結(jié)構(gòu)及致密程度等。
　　結(jié)果:將突變體外送測序發(fā)現(xiàn),該載體中已經(jīng)成功插入了目標基因gcgasa。與此同時,12個半胱氨酸

3、突變位點也被成功引入載體中。SDS-PAGE結(jié)果表明,包涵體在誘導表達的蛋白中大量存在。大腸桿菌工程菌抗氧化活性實驗表明,表達野生型GcGASA蛋白的大腸桿菌能夠耐受一定濃度的H2O2,但突變后突變體的抗氧化活性有所降低。包涵體抗氧化活性實驗顯示,對于野生型蛋白,它具有清除 H2O2能力,且隨著蛋白濃度的提高,清除能力增強;對于突變體,即便是在較高濃度下,清除H2O2能力也不強。此外,我們通過比較DTT處理的結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于野生型GcGAS