多重信號放大策略用于循環(huán)microRNA的檢測研究.pdf

1、循環(huán)microRNA是目前一個相當(dāng)活躍的研究領(lǐng)域，它對于探索生命現(xiàn)象、疾病發(fā)生機制、疾病診斷與預(yù)后、基因治療、藥物開發(fā)等方面都具有重大意義。然而傳統(tǒng)的循環(huán)microRNA檢測技術(shù)大多操作復(fù)雜且受靈敏度等方面的限制，往往不能滿足考察循環(huán)microRNA生物功能的需要。
　　環(huán)糊精聚合物不僅保持了環(huán)糊精的包絡(luò)識別能力，且具有穩(wěn)定性增強、溶解度增大、交聯(lián)劑效應(yīng)及多價結(jié)合效應(yīng)等優(yōu)點，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)B-環(huán)糊精聚合物對芘有較強的熒光增強

2、作用，可與其它檢測技術(shù)結(jié)合從而提高分析方法的靈敏度?；诖?，本文基于B-環(huán)糊精聚合物對芘的熒光增強作用并結(jié)合工具酶的優(yōu)點，發(fā)展了快速簡便的高靈敏分析方法用于循環(huán)microRNA的檢測，具體內(nèi)容如下：
　　1．基于B-環(huán)糊精聚合物對芘的熒光增強效果，設(shè)計了以DNA聚合酶與Lambda核酸外切酶為工具酶、3'端標(biāo)芘且5'端磷酸化的分子信標(biāo)為報告探針，實現(xiàn)了microRNA-21的高靈敏檢測。在目標(biāo)microRNA存在時，該體系依次發(fā)生

3、兩步反應(yīng)：
　?。?）DNA聚合酶輔助的等溫鏈置換放大反應(yīng)；
　?。?）Lambda核酸外切酶輔助的循環(huán)酶切放大反應(yīng)。兩步反應(yīng)的結(jié)果生成大量位于單核苷酸上的芘，并嵌入B-環(huán)糊精聚合物的空腔內(nèi)，引起熒光信號的顯著增強。反之，在沒有目標(biāo)microRNA存在時，位于分子信標(biāo)上的芘由于大的空間位阻難以嵌入B-環(huán)糊精聚合物空腔內(nèi)，因而熒光信號很弱。本方法中的分子信標(biāo)不需要淬滅基團的參與，選擇性和靈敏度均較好，對microRNA的檢測限

4、為0.3 pM。同時可以在人血清中進行檢測，有望在臨床檢驗等方面得到應(yīng)用。
　　2．基于B-環(huán)糊精聚合物對芘的熒光增強效果，設(shè)計了以DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶及核酸外切酶III為工具酶、中間標(biāo)芘的直鏈 DNA為報告探針，實現(xiàn)了目標(biāo)DNA或microRNA的多重信號放大檢測。在目標(biāo)DNA或microRNA存在時，該體系依次發(fā)生兩步反應(yīng)：
　?。?）切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)的等溫鏈置換放大反應(yīng)；
　　（2）核酸外切酶III輔助的循環(huán)酶

5、切放大反應(yīng)。反應(yīng)生成位于單核苷酸上的芘就極易嵌入B-環(huán)糊精聚合物的空腔內(nèi)，最終引起熒光信號的顯著增強。反之，在沒有目標(biāo)DNA或microRNA存在時，位于直鏈DNA中間的芘由于大的空間位阻很難嵌入B-環(huán)糊精聚合物空腔內(nèi)，因而熒光信號很弱。該方法探針設(shè)計簡便，特異性好，靈敏度高，對DNA檢測下限可達41fM。同時該方法還用于人血清樣品中microRNA檢測，有望發(fā)展為一種通用的核酸檢測平臺。此外，本文還基于上述方法考察了水環(huán)境污染物對核酸