地衣芽孢桿菌GXT-1兩個(gè)堿性蛋白酶基因的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究及分子改造.pdf

1、堿性蛋白酶作為一種工業(yè)上非常重要的酶類，占據(jù)全球酶市場(chǎng)的30％，獲得新型優(yōu)良的堿性蛋白酶基因，深化堿性蛋白酶的研究理論，對(duì)堿性蛋白酶的開發(fā)和應(yīng)用具有重要的意義。
　　 本研究從自然界篩選到一株產(chǎn)耐堿性蛋白酶的野生菌株，初步鑒定為地衣芽孢菌屬，命名為Bacillus licheniformis GXT-1。并成功地從該菌株的基因組DNA中克隆到二個(gè)堿性蛋白酶基因bl1、bl2，在大腸桿菌成功表達(dá)并通過鎳柱親和層析獲得純化重組酶BL

2、1、BL2，其中BL1成熟的酶蛋白分子量大小為33KD，BL2成熟的酶蛋白分子量大小為27KD。
　　 酶學(xué)性質(zhì)研究表明BL1、BL2都屬于蛋白酶S8家族。以酪蛋白為底物時(shí)，BL1的最適反應(yīng)pH為10.0，在pH7.0-pH11.0有80％以上的相對(duì)活力，最適反應(yīng)溫度溫度為70℃，比活為14643U/mg，Km值為3.80mg/mL，最大反應(yīng)速度Vmax為19803 U/mg。BL2的最適反應(yīng)pH為10.0，在pH8.0-pH1

3、1有80％以上的相對(duì)活力，最適反應(yīng)溫度溫度為70℃，比活為21855 U/mg，Km值為13.59 mg/mL，最大反應(yīng)速度Vmax為48278 U/mg。
　　 利用反向PCR對(duì)重組酶BL1、BL2進(jìn)行初步分子改造，得到7個(gè)突變子M94S、M248S、M255S、M284S以及M118A、M134S、M221S，其中突變子M94S和M134S酶活缺失，M248S、M255S、M118A、M221S的Km值有所降低，但只有M24