柴胡皂苷-d對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+和STIM1調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 觀察柴胡皂苷-d(Saikosaponin-D,SS-D)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞H4-IIE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響,探討SS-D誘導(dǎo)H4-IIE細(xì)胞內(nèi)Ca2+和STIM1的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：
　　 陰性對(duì)照組為終濃度為50μM石膽酸(LCA)、陽(yáng)性對(duì)照組為300μM熊脫氧膽酸(UDCA)加50μM LCA及處理組為終濃度為30μM、50μM、70μM、100μM的柴胡皂苷-D(SS-D)分別加50μM

2、 LCA,處理H4-IIE細(xì)胞12h后,噻唑藍(lán)(MTT)比色觀察SS-D對(duì)細(xì)胞的存活率來(lái)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)用藥濃度,熒光指示劑Fluo-3/AM測(cè)定H4-IIE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,半定量RT-PCR檢測(cè)STIM1 mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)噻嘩藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)終濃度分別為101μM、30μM、50μM、70μM、100μM、120μM SS-D處理H4-IIE細(xì)胞12h后,結(jié)果顯示10μM、30μM、50

3、μM、70μM、100μMSS-D對(duì)細(xì)胞的存活率都在90％以上,兩兩比較無(wú)差異(P＞0.05),而與對(duì)照組相比有差異(P＜0.05):120μM SS-D對(duì)細(xì)胞的存活率為88.88%,與對(duì)照組及10μM、30μM、50μM、70μM、1000μMSS-D處理組相較有意義(P＜0.05)。
　　 (2)熒光指示劑Fluo-3/AM結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)果顯示陰性對(duì)照組可引起胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高,其平均熒光強(qiáng)度(MFI)為

4、35.76±1.37;陽(yáng)性對(duì)照組可使其大幅度升高,其MFI值為74.74±1.26;不同濃度的SS-D也可使其不同程度升高,并且與SS-D呈濃度依賴性,其平均熒光強(qiáng)度(MFI)分別為59.95±1.02、73.89±1.35、80.30±0.04、93.30±0.83:陽(yáng)性對(duì)照組及處理組的MFI值明顯高于陰性對(duì)照組,兩兩相較差異顯著(P＜0.05);50μM SS-D的MFI值與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng),兩者相較無(wú)差異(P＞0.05);30μM

5、SS-D處理組MFI值低于陽(yáng)性對(duì)照組,兩者相較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);70μM及100μM SS-D處理組MFI值都高于陽(yáng)性對(duì)照組,兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);尤其是100μM SS-D誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的效果最強(qiáng);LCA及SS-D、UDCA都能誘導(dǎo)細(xì)胞鈣庫(kù)中鈣離子釋放。
　　 (3)SS-D及UDCA能增強(qiáng)H4-IIE細(xì)胞中基質(zhì)相互作用因子1(STIM1)基因mRNA的表達(dá),其基因mRNA的表達(dá)量明顯高于空白組及

6、陰性對(duì)照組,兩兩比較差異有意義(P＜0.05);30μMSS-D處理組基因表達(dá)量低于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05);70μM及100μM SS-D處理組基因表達(dá)量高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05);50μMSS-D處理組基因表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)(P＞0.05):LCA能抑制H4-IIE細(xì)胞中STIM1基因mRNA表達(dá),其基因mRNA的表達(dá)量低于空白組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、濃度為10μM、30μM、50μM

7、、70μM、100μM SS-D對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響,說(shuō)明以上濃度作用細(xì)胞12h是合適的。
　　 2、SS-D能誘導(dǎo)細(xì)胞鈣庫(kù)中鈣離子釋放及增加H4-IIE胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]cyt),并且呈濃度依賴性;濃度為30μM SS-D處理組誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的作用不及陽(yáng)性對(duì)照組,而50μM SS-D處理組對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+影響與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng),并隨著藥物濃度的增大,作用逐漸增強(qiáng)。
　　 3、SS-D可能通過(guò)上調(diào)STIM1