桿狀病毒基因連續(xù)缺失方法的建立及其應(yīng)用于初級(jí)感染因子功能研究.pdf

1、通過(guò)在桿狀病毒基因組中對(duì)基因進(jìn)行缺失構(gòu)建基因缺失突變體病毒是研究基因功能的主要方法之一。傳統(tǒng)的桿狀病毒基因缺失方法以在昆蟲細(xì)胞宿主內(nèi)同源重組方式為主，通過(guò)構(gòu)建含同源重組臂和合適篩選標(biāo)記的重組載體和目標(biāo)病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主昆蟲細(xì)胞，借助昆蟲細(xì)胞內(nèi)自身重組酶進(jìn)行同源重組，利用篩選標(biāo)記獲得目標(biāo)缺失型病毒。然而該方法重組效率非常低(0.1％-1％)，需要多輪空斑純化(3-5輪)才能獲得目標(biāo)病毒，因此復(fù)雜費(fèi)時(shí)。在研究功能相關(guān)基因時(shí)，經(jīng)常需

2、要依次缺失數(shù)個(gè)基因，傳統(tǒng)方法由于篩選標(biāo)記有限，重組效率低下，篩選過(guò)程復(fù)雜等限制幾乎難以進(jìn)行多個(gè)基因缺失。由桿狀病毒基因改造而成的Bacmid可以在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制生存，因此在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行基因缺失獲得基因缺陷型重組Bacmid變得相對(duì)簡(jiǎn)單。借助red重組系統(tǒng)和抗生素篩選標(biāo)記，在細(xì)菌內(nèi)缺失目標(biāo)基因效率得以顯著提高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單快速。由于抗生素標(biāo)記畢竟有限，所以在連續(xù)缺失基因時(shí)依然顯得不夠理想。此外，由于篩選標(biāo)記基因相對(duì)較大(約1000bp)，在

3、重組進(jìn)基因組中容易造成鄰位效應(yīng)而影響旁邊基因功能，從而使得研究結(jié)果可能發(fā)生一定的誤差。因此通過(guò)正反向篩選方法，在缺失目標(biāo)基因后，將篩選標(biāo)記去掉，實(shí)現(xiàn)無(wú)縫缺失，對(duì)精確研究基因功能具有較大意義。由于正反向篩選可以連續(xù)使用同一個(gè)篩選標(biāo)記，去掉篩選標(biāo)記后也不會(huì)在基因組內(nèi)留下多余堿基，因此是一種應(yīng)用廣泛的在細(xì)菌內(nèi)缺失BAC(細(xì)菌人工染色體)上靶標(biāo)基因的方法。目前使用的正反向篩選標(biāo)記有ThyA和galk系統(tǒng)，其基本原理比較類似。即首先通過(guò)設(shè)計(jì)含50

4、bp同源重組臂的引物，擴(kuò)增出含同源臂的thyA或galK基因，將此PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化進(jìn)能thyA或者galk缺陷型宿主大腸桿菌，在red重組酶介導(dǎo)下含重組臂的thyA或galk基因置換掉BAC中目的基因，導(dǎo)致陽(yáng)性菌落能夠在不補(bǔ)加胸腺嘧啶或者半乳糖的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在成功置換掉目的基因后，需要利用反向篩選物將篩選標(biāo)記基因剔除。使用重疊PCR方法(overlapping)將原先左右各50bp同源臂連接成100bp產(chǎn)物，經(jīng)電轉(zhuǎn)化宿主菌，在重組

5、酶的介導(dǎo)下將篩選標(biāo)記基因thyA或者galk置換出來(lái)，陽(yáng)性菌落可以再補(bǔ)加了方向篩選物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而去掉篩選基因。通過(guò)這樣一個(gè)2次重組，篩選標(biāo)記可以多次使用。這種正反向篩選的重組效率可以達(dá)到70-80％左右，由于需要電轉(zhuǎn)化PCR產(chǎn)物，重疊PCR等過(guò)程，其實(shí)際效率和操作稍顯繁瑣復(fù)雜，因此在連續(xù)缺失多個(gè)基因時(shí)依然比較耗時(shí)。因此有必要對(duì)連續(xù)缺失方法做進(jìn)一步改進(jìn)，使其效率最大化，為研究桿狀病毒基因功能提供高效方法。 本研究利用細(xì)菌間

6、結(jié)合轉(zhuǎn)移，條件復(fù)制型質(zhì)?？寺CR產(chǎn)物，I-SCEI線性化供體載體，細(xì)菌間同源重組，galk，ThyA，rspl正反向篩選技術(shù)建立高效基因連續(xù)缺失方法。首先構(gòu)建出能夠克隆PCR產(chǎn)物的條件復(fù)制型多功能R6k-T載體，該載體即可以克隆3’A產(chǎn)物(常規(guī)Taq)，也可以克隆平末端PCR產(chǎn)物(PFU酶)，該載體使用R6kY復(fù)制子，含2個(gè)I-sceI位點(diǎn)，只能在表達(dá)pir菌株中生存(Bw23474或者Bun20)，無(wú)法在常規(guī)宿主菌中復(fù)制與存活。PC

7、R產(chǎn)物克隆到T載體中，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移方式進(jìn)入Bacmid宿主菌。Bacmid宿主菌為通過(guò)改造的能表達(dá)I-SECI歸位酶的galk缺陷型宿主菌，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下，所表達(dá)的歸位酶能夠線性化T載體，釋放出所攜帶的同源重組臂與篩選標(biāo)記基因。42度誘導(dǎo)下，產(chǎn)生red-gam重組酶，介導(dǎo)篩選標(biāo)記基因與Bacmid目的片段發(fā)生同源重組，陽(yáng)性重組菌落能夠在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。通過(guò)合適酶切位點(diǎn)(Bsu36I)切除篩選標(biāo)記并自聯(lián)，只保留100bp同源重組臂。再

8、次通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入陽(yáng)性重組菌，通過(guò)誘導(dǎo)I-sceI線性化載體，高溫誘導(dǎo)RED重組酶發(fā)生同源重組去掉Bacmid中的篩選標(biāo)記，并通過(guò)補(bǔ)加反向篩選化合物的平板進(jìn)行篩選。如此可以達(dá)到循環(huán)使用篩選標(biāo)記來(lái)連續(xù)缺失多個(gè)基因，并且該方法不需要電轉(zhuǎn)化PCR產(chǎn)物，不需要二次重疊PCR，直接利用結(jié)合轉(zhuǎn)移方式傳送DNA片段，操作方便快速，重組效率增加到90％以上。尤其在連續(xù)缺失3個(gè)以上基因能夠充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，為研究由多個(gè)基因控制的生物功能提供最佳方