高致病性PRRSV WUH3株分離鑒定及體外傳代的遺傳變異研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種傳染病,以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀引起高死亡率為特征。早在1987年該病在美國南部被報道,隨后遍及世界各地,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 2006年,我國暴發(fā)了一種“豬高熱綜合癥”,以高發(fā)病率、高熱和高死亡率為特征。研究者通過很多研究,證實高致病性PRRSV變異株是“豬高熱綜合癥”的主要病原。針對這種新的PRRSV,本研究進行

2、了病毒的分離與鑒定,將分離毒株WUH3株在Marc-145細(xì)胞上進行體外傳代傳75代,對WUH3株親本株、第25代(P25)、第50代(P50)、第75代(P75)進行全基因組測序,利用分子生物學(xué)各種軟件對不同代次細(xì)胞毒全基因組做生物信息學(xué)分析,研究WUH3株在體外傳代過程中傳代毒株之間遺傳進化規(guī)律,為高致病性PRRSV WUH3株不同代次細(xì)胞毒之間氨基酸的變異和毒力的關(guān)系提供分子水平的依據(jù),為研發(fā)高致病性PRRSV弱毒疫苗提供理論和技

3、術(shù)上的支持。主要研究內(nèi)容包括:
　　 1.高致病性PRRSV WUH3株的分離、鑒定
　　 在“豬高熱綜合癥”發(fā)生時期利用Marc-145細(xì)胞對疑似發(fā)病豬的組織進行病毒分離,并通過RT-PCR、間接免疫熒光等試驗證實分離的病毒為PRRSV,命名為PRRSV WUH3株。
　　 2.高致病性PRRSV WUH3株的體外傳代
　　 高致病性PRRSV WUH3株利用Marc-145細(xì)胞體外傳代至75代,第5代

4、細(xì)胞毒接毒后3 d出現(xiàn)局灶性病變,5 d后出現(xiàn)70％細(xì)胞病變。隨著傳代次數(shù)不斷增加,出現(xiàn)細(xì)胞病變的時間不斷縮短,由最初3 d縮短到75代的24 h,產(chǎn)生70％細(xì)胞病變的時間由最初5 d縮短到第75代的48 h,TCID50殖總體呈上升趨勢,毒量不斷地增高,這說明在體外傳代過程中WUH3株適應(yīng)細(xì)胞能力不斷增強。
　　 3.高致病性PRRSV WUH3株全基因組的序列分析
　　 將高致病性PRRSV WUH3株及其傳代細(xì)胞毒

5、株P(guān)25,P50,P75做全基因序列測定并進行分析。全基因組序列比對結(jié)果表明,PRRSV WUH3株及其傳代細(xì)胞毒株與國內(nèi)現(xiàn)在流行的高致病性PRRSV具有相似的遺傳標(biāo)記,即Nsp2存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失以及5’UTR和3’UTR各缺失一個堿基。
　　 與WUH3株親本株相比,WUH3株傳代細(xì)胞毒P75存在149個核苷酸突變,導(dǎo)致了65個氨基酸發(fā)生有義突變。利用各種生物學(xué)軟件對4代全基因組序列及氨基酸做生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯

6、示,很多氨基酸突變位于PRRSV基因組功能區(qū)。比如信號肽序列(P4SORF4),跨膜區(qū)序列(L172FORF4,P173AORF4,S174IORF4),N-糖基化位點序列(S133NORF3),有些抗原表位也發(fā)生了變化(A181TNSP2),這些氨基酸的突變可能在病毒的復(fù)制,蛋白轉(zhuǎn)運,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有一定作用。另外,PRRSV WUH3株傳代與JXA1株同步傳代過程中有8個位點的突變方向相似,即E303DNSP2,E296DNSP3,N1