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文檔簡介
1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),俗稱藍耳病,該病自發(fā)現(xiàn)以來給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失,而2006年在我國出現(xiàn)的高致病性藍耳病更是給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了幾乎是毀滅性的打擊。豬繁殖與呼吸綜合征的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV),PRRS
2、V的基因組為一條具有甲基化帽和poly(A)尾的單股正鏈RNA,5'末端為帽子結構和5'非編碼區(qū)(5'Untranslated region,5'UTR),3'末端為3'非編碼區(qū)(3'UTR)和poly(A)尾,中間包含10個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。
已證實動脈炎病毒的基因組UTR在病毒基因組RNA復制、亞基因組mRNA轉錄和蛋白翻譯過程中發(fā)揮著關鍵的作用,但其在誘導干擾素(Interfer
3、on,IFN)中的作用尚不清楚。為了探究PRRSV UTR在誘導干擾素中的作用,我們開展了以下研究工作:
1.PRRSV WUH3株非編碼區(qū)在Marc-145細胞中誘導IFN-β能力的研究
為了研究PRRSV WUH3 UTR在Marc-145細胞中是否可以誘導IFN-β,體外轉錄并純化3'UTR和5'UTR。將IFN-β啟動子熒光素酶報告質粒pIFN-β-Luc和內參質粒pRL-TK共轉染Marc-145細胞,24
4、h后轉染UTR,于轉染后不同時間點收集細胞樣品,利用熒光素酶檢測系統(tǒng)分析IFN-β啟動子活性,結果轉染UTR細胞的熒光素酶活性顯著高于陰性對照細胞(轉染tRNA),并且轉染5'UTR細胞的熒光素酶活性顯著高于陽性對照細胞(轉染poly(I∶C)),說明PRRSV WUH3株UTR可以激活IFN-β啟動子,而且5'UTR具有更強的激活能力。
進一步將PRRSV WUH3株3'UTR和5'UTR分別轉染Marc-145細胞,并于轉
5、染后不同時間點收集細胞和細胞上清,利用熒光定量RT-PCR檢測IFN-βmRNA表達水平,ELISA檢測IFN-β蛋白表達水平。結果顯示3'UTR和5'UTR在不同時間點均能顯著增強IFN-βmRNA和蛋白的表達。
2.UTR的5'-ppp對UTR誘導IFN-β能力影響的研究
天然狀態(tài)下,5'UTR的5'端被磷酸化,3'UTR的5'端沒有被磷酸化,而我們利用體外轉錄方法得到的UTR的5'端均被磷酸化。為了模擬真實狀態(tài)
6、,了解5'-ppp在UTR誘導IFN-β過程中的作用,用牛小腸堿性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase,CIP)對體外轉錄獲得的UTR進行去磷酸化處理,轉染細胞后利用ELISA試劑盒檢測IFN-β的表達情況,結果證實去磷酸化的UTR仍然可以誘導IFN-β的產生,但其誘導能力顯著下降,說明5'-ppp能增強UTR誘導IFN-β的能力。由此推斷,PRRSV基因組5'端的磷酸化可能有助于細胞識別病毒
7、。
3.UTR的二級結構對UTR誘導IFN-β能力影響的研究
眾所周知,病毒的基因組并非完全呈線性化狀態(tài),其堿基間可相互配對形成二級結構。為了研究UTR的二級結構在其誘導IFN-β的過程中的作用,分別用變性和復性緩沖液處理體外轉錄獲得的UTR,使其處于變性或復性狀態(tài),轉染細胞后,利用熒光素酶檢測系統(tǒng)分析IFN-β啟動子活性,結果轉染變性UTR的細胞熒光素酶活性顯著下降,且5'UTR的激活能力下降較3'UTR下降顯著。
8、同時RNA二級結構的預測表明5'UTR具有更復雜的二級結構,實驗結果提示UTR的二級結構可以增強其對IFN-β的誘導能力。
4.不同UTR缺失突變體誘導IFN-β能力差異的研究
為了研究UTR中是否存在可以特異性誘導IFN-β的區(qū)域,根據(jù)二級結構的預測結果制備了一系列UTR的缺失突變體,轉染細胞,利用熒光素酶檢測系統(tǒng)分析IFN-β啟動子活性,結果發(fā)現(xiàn)轉染不同UTR缺失突變體的細胞熒光素酶活性存在顯著差異,說明UTR中
9、可能存在可以被模式識別受體特異性識別的區(qū)域。
5.利用siRNA技術初步探究UTR激活IFN-β的信號通路的研究
RNA可以被TLR3(Toll-like receptors 3,TLR3)識別,招募TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β),或者被RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible geneⅠ)/MDA5(Melanoma diffe
10、rentiation-associated gene-5)識別募集IPS-1(IFN-β promoter stimulator 1)和STING(Stimulator of interferon genes),然后分別活化其下游分子,最終激活IRF3(Interferon regulation factor 3)及NF-κB(Nuclear factor-kappa B),調控IFN-β的產生。為了探究UTR誘導IFN-β產生的機制,
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