PRRSV WUH3株非編碼區(qū)誘導(dǎo)IFN-β有能力及其機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），俗稱藍(lán)耳病，該病自發(fā)現(xiàn)以來給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而2006年在我國出現(xiàn)的高致病性藍(lán)耳病更是給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了幾乎是毀滅性的打擊。豬繁殖與呼吸綜合征的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV），PRRS

2、V的基因組為一條具有甲基化帽和poly(A)尾的單股正鏈RNA，5'末端為帽子結(jié)構(gòu)和5'非編碼區(qū)(5'Untranslated region，5'UTR)，3'末端為3'非編碼區(qū)(3'UTR)和poly(A)尾，中間包含10個(gè)開放閱讀框(Open reading frame，ORF)。
　　已證實(shí)動(dòng)脈炎病毒的基因組UTR在病毒基因組RNA復(fù)制、亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，但其在誘導(dǎo)干擾素（Interfer

3、on，IFN）中的作用尚不清楚。為了探究PRRSV UTR在誘導(dǎo)干擾素中的作用，我們開展了以下研究工作:
　　1.PRRSV WUH3株非編碼區(qū)在Marc-145細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-β能力的研究
　　為了研究PRRSV WUH3 UTR在Marc-145細(xì)胞中是否可以誘導(dǎo)IFN-β，體外轉(zhuǎn)錄并純化3'UTR和5'UTR。將IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pIFN-β-Luc和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，24

4、h后轉(zhuǎn)染UTR，于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞樣品，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)分析IFN-β啟動(dòng)子活性，結(jié)果轉(zhuǎn)染UTR細(xì)胞的熒光素酶活性顯著高于陰性對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染tRNA)，并且轉(zhuǎn)染5'UTR細(xì)胞的熒光素酶活性顯著高于陽性對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染poly(I∶C))，說明PRRSV WUH3株UTR可以激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子，而且5'UTR具有更強(qiáng)的激活能力。
　　進(jìn)一步將PRRSV WUH3株3'UTR和5'UTR分別轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)

5、染后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和細(xì)胞上清，利用熒光定量RT-PCR檢測IFN-βmRNA表達(dá)水平，ELISA檢測IFN-β蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示3'UTR和5'UTR在不同時(shí)間點(diǎn)均能顯著增強(qiáng)IFN-βmRNA和蛋白的表達(dá)。
　　2.UTR的5'-ppp對UTR誘導(dǎo)IFN-β能力影響的研究
　　天然狀態(tài)下，5'UTR的5'端被磷酸化，3'UTR的5'端沒有被磷酸化，而我們利用體外轉(zhuǎn)錄方法得到的UTR的5'端均被磷酸化。為了模擬真實(shí)狀態(tài)

6、，了解5'-ppp在UTR誘導(dǎo)IFN-β過程中的作用，用牛小腸堿性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)對體外轉(zhuǎn)錄獲得的UTR進(jìn)行去磷酸化處理，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后利用ELISA試劑盒檢測IFN-β的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)去磷酸化的UTR仍然可以誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，但其誘導(dǎo)能力顯著下降，說明5'-ppp能增強(qiáng)UTR誘導(dǎo)IFN-β的能力。由此推斷，PRRSV基因組5'端的磷酸化可能有助于細(xì)胞識別病毒

7、。
　　3.UTR的二級結(jié)構(gòu)對UTR誘導(dǎo)IFN-β能力影響的研究
　　眾所周知，病毒的基因組并非完全呈線性化狀態(tài)，其堿基間可相互配對形成二級結(jié)構(gòu)。為了研究UTR的二級結(jié)構(gòu)在其誘導(dǎo)IFN-β的過程中的作用，分別用變性和復(fù)性緩沖液處理體外轉(zhuǎn)錄獲得的UTR，使其處于變性或復(fù)性狀態(tài)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)分析IFN-β啟動(dòng)子活性，結(jié)果轉(zhuǎn)染變性UTR的細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降，且5'UTR的激活能力下降較3'UTR下降顯著。

8、同時(shí)RNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明5'UTR具有更復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示UTR的二級結(jié)構(gòu)可以增強(qiáng)其對IFN-β的誘導(dǎo)能力。
　　4.不同UTR缺失突變體誘導(dǎo)IFN-β能力差異的研究
　　為了研究UTR中是否存在可以特異性誘導(dǎo)IFN-β的區(qū)域，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果制備了一系列UTR的缺失突變體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)分析IFN-β啟動(dòng)子活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染不同UTR缺失突變體的細(xì)胞熒光素酶活性存在顯著差異，說明UTR中

9、可能存在可以被模式識別受體特異性識別的區(qū)域。
　　5.利用siRNA技術(shù)初步探究UTR激活I(lǐng)FN-β的信號通路的研究
　　RNA可以被TLR3（Toll-like receptors 3，TLR3）識別，招募TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β)，或者被RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible geneⅠ)/MDA5(Melanoma diffe

10、rentiation-associated gene-5)識別募集IPS-1(IFN-β promoter stimulator 1)和STING(Stimulator of interferon genes)，然后分別活化其下游分子，最終激活I(lǐng)RF3（Interferon regulation factor 3）及NF-κB(Nuclear factor-kappa B)，調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生。為了探究UTR誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制，