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    • 簡介:南方醫(yī)科大學(xué)2010級碩士學(xué)位論文CD133逄I血祖細(xì)胞對大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響與探討EFFECTIONOFCD133POSITIVEHEMOPOIETICPROGENITORCELLSONHUMANCOLORECTALCARCINOMACELLLINEANDDISCUSSION課題來源國家自然科學(xué)基金資助學(xué)位中請人導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學(xué)院周春平李學(xué)農(nóng)教授病理學(xué)與病理生理學(xué)科學(xué)型碩士基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2013年5月20日廣州中文摘要細(xì)胞。KAPLANRN發(fā)現(xiàn)了VEGFRL陽性造血祖細(xì)胞VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTORRECEPTOR1POSITIVEHEMATOPOIETICPROGENITORCELL,VEGFRLHPC在動物腫瘤轉(zhuǎn)移中起到?jīng)Q定的作用,VEGFRLHPC并非以前發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞ENDOTHELIALPROGENITORCELL,EPC即VEGFI也陽性造血祖細(xì)胞,而是同時具備CDL33和VEGFRL兩種標(biāo)記的一種造血祖細(xì)胞,因為腹腔注射VEGFR2抗體,不能阻斷VEGFRLHPC細(xì)胞簇形成及瘤轉(zhuǎn)移灶形成,只能限制腫瘤轉(zhuǎn)移灶生長。利用B半乳糖苷酶標(biāo)記骨髓細(xì)胞移植的小鼠LEWIS_『I癌模型、小鼠B16黑色素瘤模型ALEMYC轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性淋巴瘤模型發(fā)現(xiàn)VEGFRLHPC首先在特定器官形成細(xì)胞簇VEGFRLHPCCELLULARCLUSTERS,為瘤細(xì)胞準(zhǔn)備了易于形成轉(zhuǎn)移的微環(huán)境,這些細(xì)胞簇形成部位與腫瘤轉(zhuǎn)移常見部位一致。腫瘤轉(zhuǎn)移到某種特定器官的細(xì)胞和分子機(jī)制還不是很清楚,但是很多腫瘤都有轉(zhuǎn)移到某一特定器官的傾向。依靠腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞標(biāo)簽VEGFRL造血祖細(xì)胞在靶器官形成轉(zhuǎn)移的微環(huán)境,促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但目前的研究均采用動物受致死性輻射后進(jìn)行骨髓移植的研究方法,各器官存在輻射損傷后可能會造成非特異性骨髓動員及骨髓來源細(xì)胞的聚集,且尚未在人癌實驗層次獲得證實。臍帶血,是指胎兒出生后,殘留在臍帶和胎盤絨毛血管內(nèi)的血液。在胚胎發(fā)生過程中,32周胎齡前的胎兒循環(huán)中含有豐富的造血祖細(xì)胞,至34周齡時大部分的已完成遷移,但在出生前胎兒的血循環(huán)中仍含有較多的造血祖細(xì)胞成分,只出生數(shù)月后刁‘降至成人外周血水平,臍血中的造血祖細(xì)胞的抗原性較弱,移植相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生率較骨髓和外周血少,且癥狀輕,采集保存容易,對供者無任何傷害,因此被認(rèn)為是極具潛力的新的造血祖細(xì)胞來源人CD133高親和肽TR7是本課題組前期在篩選出鼠高親和肽的基礎(chǔ)上篩選出來的,經(jīng)證實能與人細(xì)胞上的CDL33特異結(jié)合。本研究重點探討
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      上傳時間:2024-03-13
      頁數(shù): 63
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    • 簡介:該研究是為了觀察后縱韌帶骨化患者非骨化部位的脊柱韌帶在體外培養(yǎng)條件下的形態(tài)學(xué)特征、成骨能力BMP2及TNFΑ在后縱韌帶組織中的表達(dá)情況骨形態(tài)發(fā)生蛋白2與腫瘤壞死因子Α及兩者協(xié)同作用在后縱韌帶成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖、膠原合成、ALP活性及骨鈣素分泌水平的影響同時探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白2與腫瘤壞死因子Α聯(lián)合誘導(dǎo)脊柱韌帶成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞表型中核結(jié)合因子CBFAL表達(dá)的可能性、SMAD1與SMAD5在其中的信號傳導(dǎo)作用及分子機(jī)制結(jié)論①后縱韌帶骨化患者脊柱韌帶細(xì)胞體外培養(yǎng)可表達(dá)成骨細(xì)胞表型后縱韌帶骨化患者的某些成骨因子可能分泌異常②TNFΑ與BMP2聯(lián)合作用可誘導(dǎo)脊柱韌帶成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞表型BMP2與TNFΑ在OPLL的發(fā)生中可能起著重要作用③TNFΑ的刺激可能為BMP2提供了與其結(jié)合的受體它還可能通過RAS激活的ERK途徑誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)基因④TNFΑ與BMP2在誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞表型中起著協(xié)同作用
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      上傳時間:2024-03-11
      頁數(shù): 94
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      ( 4 星級)
    • 簡介:MICRORNA一185負(fù)向調(diào)控雄激素受體抑制前列腺癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的作用機(jī)制研究MICRORNA185DIRECTLYTARGETSANDROGENRECEPTORANDSUPPRESSESPROLIFERATION,INVASION,MIGRATIONANDTUMORIGENICITYOFHUMANPROSTATECANCERCELLS研究生姓名曲發(fā)軍學(xué)科和專業(yè)外科學(xué)泌尿外科培養(yǎng)單位第二軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院研究方向泌尿系統(tǒng)腫瘤指導(dǎo)教師徐丹楓教授導(dǎo)師組成員王全興劉玉杉教授副教授課題來源國家自然科學(xué)基金論文提交日期2012年4月學(xué)位授予日期2012年7月●■■■R\\料1㈣09刪4B\Y21獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。靴敝儲攤尚弩嘲砂年妒T7日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)聲明本人完全了解第二軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,第二軍醫(yī)大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版,允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)第二軍醫(yī)大學(xué)可以將學(xué)位論文全文或部分內(nèi)容編入中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫、中國優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索??梢圆捎糜坝 ⒖s印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書學(xué)位論文作者簽名F慨導(dǎo)師簽名日期加許籮月1日帆嘶177日
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      上傳時間:2024-03-11
      頁數(shù): 76
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      ( 4 星級)
    • 簡介:生物醫(yī)用材料是材料科學(xué)技術(shù)的一個分支,相關(guān)研究涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最基本的科學(xué)問題。為了探討無生命的物質(zhì)參與構(gòu)建有生命組織的機(jī)制,開展了鈣磷降解材料生物礦化的細(xì)胞分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究。設(shè)計并建立了細(xì)胞培養(yǎng)→基因克隆→基因表達(dá)→蛋白質(zhì)純化→蛋白質(zhì)分子與材料作用的系統(tǒng)研究模式。首先采用酶消化法和植塊法從WISTAR乳鼠顱骨體外分離培養(yǎng)了大鼠成骨細(xì)胞,兩種方法獲得的成骨細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)和純化后,顯示出高的堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力,具有良好的生物學(xué)特性。將原代培養(yǎng)后傳至第3代、經(jīng)過純化、狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞進(jìn)行凍存,復(fù)蘇后存活率達(dá)93%,堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性,有鈣結(jié)節(jié)形成,可擴(kuò)增堿性磷酸酶基因,與未凍存細(xì)胞比較,復(fù)蘇細(xì)胞的生物學(xué)特性無明顯改變;設(shè)計了一對PCR反應(yīng)特異性引物F1、R1,從酶消化法分離培養(yǎng)的WISTAR乳鼠成骨細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出骨粘連蛋白的編碼區(qū)CDNA序列,將PCR產(chǎn)物插入PBST載體,測序并與GENBANK核酸數(shù)據(jù)庫比對,其序列與GENBANK核酸數(shù)據(jù)庫中收錄的一致;將大鼠骨粘連蛋白基因重組到原核表達(dá)載體PGEXKG中,構(gòu)建了正確的表達(dá)載體PGEXKGON,在大腸桿菌ECOLIBL21DE3PLYSS中實現(xiàn)了全長表達(dá),表達(dá)的融合蛋白存在于細(xì)菌裂解液上清中,上清中的目的蛋白采用硫酸銨分級沉淀、超濾膜分離、GST親和層析逐步純化,獲得了高純度的大鼠骨粘連蛋白;將大鼠成骨細(xì)胞與鈣磷材料混合培養(yǎng),顯微鏡下可觀察到成骨細(xì)胞對鈣磷材料有明顯的吞噬作用;細(xì)胞計數(shù)、MTT和CKK8等實驗結(jié)果表明,鈣磷材料有利于成骨細(xì)胞增殖;將骨粘連蛋白與CA2離子作用,采用等離子體發(fā)射光譜儀進(jìn)行檢測,證明所獲得的骨粘連蛋白可結(jié)合鈣離子;骨粘連蛋白與鈣磷材料作用后,SEM、XRD、XPS測試結(jié)果顯示,蛋白在鈣磷材料表面發(fā)生了吸附和鍵合反應(yīng)。骨粘連蛋白通過CA2離子結(jié)合位點結(jié)合CA2,通過NH3結(jié)合PO43,并啟動羥基磷灰石晶核形成,以高的親和力吸附羥基磷灰石晶核后,從材料表面解吸,通過膠原結(jié)合位點在膠原纖維上吸附,實現(xiàn)其結(jié)合鈣磷、轉(zhuǎn)運(yùn)鈣磷、結(jié)合膠原蛋白的功能,引導(dǎo)鈣鹽在基質(zhì)中沉積和骨的礦化。
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      上傳時間:2024-03-13
      頁數(shù): 113
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      ( 4 星級)
    • 下載積分: 5 賞幣
      上傳時間:2024-03-13
      頁數(shù): 55
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    • 簡介:第一部分HIVTATCLIO標(biāo)記對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的探討HIVTAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域交聯(lián)氧化鐵復(fù)合物HIVTRANSDUCTIONDOMAINCROSSLINKEDIRONOXIDE,HIVTATCLIO標(biāo)記對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RATMARROWDERIREDMESENCHYMALSTEMCELLS,RMSCS的可行性、劑量關(guān)系以及對細(xì)胞活力、增殖、分化和遷移能力等生物學(xué)行為的影響。材料與方法原代培養(yǎng)RMSCS至第3代,檢測CD34,CD45和CD90的表達(dá)以鑒定之。不同濃度的HIVTATCLIO標(biāo)記RMSCS后利用普魯士鐵染色、體外MRI顯像及臺盼蘭細(xì)胞活性測定等方法確定最佳標(biāo)記條件。用CLIO25ΜGML和HIVTATCLIO25ΜGML分別標(biāo)記RMSCS各24H,通過普魯士蘭鐵染色比較兩組納米鐵的細(xì)胞標(biāo)記效率。運(yùn)用普魯士蘭染色及掃描電鏡技術(shù)觀察鐵顆粒的細(xì)胞內(nèi)存在部位。MTT實驗測定該標(biāo)記方法對細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞儀測定標(biāo)記前后細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)及細(xì)胞周期的變化;通過油紅0和堿性磷酸酶染色測定這種標(biāo)記方法對RMSCS細(xì)胞分化能力的影響;TRANSWELL實驗測定其對干細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果培養(yǎng)的第3代RMSCSCD34,CD45和CD90。HIVTATCLIO最佳標(biāo)記濃度為25ΜGML。HIVTATCLIO組較CLIO組在RMSCS的標(biāo)記效率上獲第一部分得明顯改善。細(xì)胞標(biāo)記后,A570波長的光吸收值無明顯變化;細(xì)胞表面CD34、CD45和CD90分子的表達(dá)無明顯差異;處于S期的MSCS數(shù)量S%、G%、增殖指數(shù)PRI值SGM%以及細(xì)胞凋亡情況均無顯著改變;這種標(biāo)記物對細(xì)胞分化和運(yùn)動遷移能力均無顯著影響。結(jié)論HIVTATCLIO標(biāo)記大鼠MSCS后對其生物學(xué)行為無明顯影響,標(biāo)記后的干細(xì)胞可以正常增殖、分化及運(yùn)動遷移,為磁共振活體監(jiān)測干細(xì)胞移植后的動態(tài)變化提供有力的保證。第二部分干細(xì)胞移植治療大鼠后肢缺血中HIVTATCLIO標(biāo)記磁共振體內(nèi)示蹤的研究目的探討磁共振成像MAGICRESONANCEIMAGING,MRI無創(chuàng)體內(nèi)示蹤HIVTATCLIOHIVTRANSDUCTIONDOMAINCROSLINKEDIRONOXIDE標(biāo)記的移植大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RATMARROWDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLS,RMSCS的可行性和有效性,并且對該標(biāo)記后的RMSCS移植治療大鼠后肢缺血的效果進(jìn)行客觀評價。材料和方法原代培養(yǎng)6周齡雄性SD大鼠的RMSCS至第3代,檢測CD34,CD45和CD90的表達(dá)以鑒定。用HIVTATCLIO25ΜGML標(biāo)記RMSCS24H。另有一組細(xì)胞繼續(xù)以5溴脫氧尿苷BRDU3ΜGML復(fù)合標(biāo)RMSCS24H。于大鼠右后肢缺血模型建立后的第7天進(jìn)行RMSCS細(xì)胞移植。選用6周齡雄性SD大鼠28只,分為4組,每組各7只。A組為移植HIVTATCLIO標(biāo)記的RMSCS;B組為移植HIVTATCLIO及BRDU復(fù)合標(biāo)記的RMSCS;C組為移植未標(biāo)記的RMSCS;D組為注射同移植體積的無菌PBS液。分別在移植術(shù)后3D、1周、2周、4周進(jìn)行MRI檢查示蹤HIVTATCIIO標(biāo)記的RMSCS分布情況C組和D組僅于術(shù)后第3D進(jìn)行MRI掃描1次。在第4周各組均采用非致冷紅外熱成像儀檢測大鼠后肢皮膚溫度,進(jìn)行缺血后肢的損傷評分,并進(jìn)行DSA造影,之后處死所有大鼠進(jìn)行組織學(xué)檢查。進(jìn)行臟染色和普魯士蘭鐵染色,BRDU、Ⅷ因子免疫組化染色,并計算毛細(xì)血管密度。結(jié)果培養(yǎng)的第3代RMSCSCD34,CD45和CD90。B組和C組各有1只實驗鼠因切口感染壞死,分別于術(shù)后第5天和第8天死亡,B組另有1只于移植術(shù)后第2周MRI檢查時麻醉意外死亡。其余25只均存活至術(shù)后第4周。MRI檢查A組和B組在MRI上的顯示接近。C組和D組在MRI上無特殊信號變化。A組和B組在術(shù)后第3D,MRI顯示注射部位圓形低強(qiáng)度信號影;術(shù)后1周,MRI顯示原低信號灶呈中心向周圍擴(kuò)散趨勢,信號呈顆粒狀,部位與隨后的組織學(xué)檢查結(jié)果一致;術(shù)后第2周見低密度影進(jìn)一步擴(kuò)散,信號強(qiáng)度有所弱化;術(shù)后第4周信號強(qiáng)度進(jìn)一步弱化。低密度顆粒擴(kuò)散范圍局限于原部位7MM處。非致冷紅外熱成像儀檢測大鼠后肢皮膚溫度發(fā)現(xiàn)A、B、C和D組的右后肢平均皮膚溫度分別為3212±051℃、3239±061℃,3097±056℃、3116±067℃。A、B、C這3組間平均皮膚溫度無顯著性差異P005,A組與D組,B組與D組,C組與D組間均有顯著性差異P005,A組與D組,B組與D組,C組與D組間均有顯著性差異P005,A組與D組,B組與D組,C組與D組間均有顯著性差異P、56302±6126MM、57697±7787MM、51301±7068MM。A、B、C這3組間毛細(xì)血管密度無顯著性差異P005,A組與D組,B組與D組,C組與D組間均有顯著性差異P005。BRDU染色、普魯士鐵染色、Ⅷ因子免疫熒光及MRI的結(jié)果有良好的相關(guān)性。結(jié)論HIVTATCLIO標(biāo)記的RMSCS移植入大鼠后肢缺血模型后可以運(yùn)用MRI進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測,根據(jù)低強(qiáng)度信號的范圍變化可以比較清晰的顯示移植后的RMSCS在宿主體內(nèi)的遷移和分布。RMSCS移植能夠提高大鼠后肢缺血組織的血管再生能力,促進(jìn)缺血肢體的血運(yùn)重建和功能恢復(fù),而HIVTATCLIO標(biāo)記并不影響RMSCS的治療作用。
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      上傳時間:2024-03-11
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    • 簡介:中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干涉RPS12基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制探討姓名閆楊申請學(xué)位級別碩士專業(yè)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師孫秀菊20070401中文論著摘要RNA干涉RPSL2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制探討摘要胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類的健康。多種癌基因和抑癌基因的異常與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但是目前關(guān)于對胃癌防治具有重要意義的靶基因報道很少。因此,研究與胃癌密切相關(guān)的基因十分必要。為此本課題組前期應(yīng)用抑制消減雜交SSH篩查發(fā)現(xiàn)一些在胃癌中差異表達(dá)的基因,進(jìn)一步應(yīng)用基因芯片、斑點雜交等技術(shù)檢測相關(guān)基因在異型增生、早期胃癌、進(jìn)展期胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌以及癌旁組織中的表達(dá),進(jìn)一步證實了這些基因在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段的差異表達(dá)情況。核糖體蛋白12RIBOSOMALPROTEINS12,脬酣2基因是其中之一。該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段病變的標(biāo)本中表達(dá)增高,是胃癌發(fā)生、發(fā)展不同階段的重要差異表達(dá)基因。但是該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用究竟如何,有待通過進(jìn)一步實驗證實。在前期工作的基礎(chǔ)上,為深入研究RPSL2基因在胃癌中的作用,本課題擬構(gòu)建RPSL2基因SHRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞并證實對RPSL2基因的抑制作用后,觀察對胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性如細(xì)胞凋亡、增殖的影響,并探討其分子機(jī)制。本研究將加深對胃癌分子機(jī)制的理解,并有望發(fā)現(xiàn)胃癌診治、預(yù)后判定的新標(biāo)志。材料及方法1.實驗材料胃癌細(xì)胞系BGC823、RPMLL640培養(yǎng)基、TRIZOLREAGENT、TAQDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒QIAGEN;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒INVITROGEN,BAMHI、HINDIII、ECORI核酸內(nèi)切酶TAKARA;PI、JML09感受
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    • 簡介:第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)化生長因子Β1基因沉默對人涎腺粘液表皮樣癌MS細(xì)胞生物學(xué)行為的影響姓名王靜申請學(xué)位級別博士專業(yè)口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)(生物學(xué))指導(dǎo)教師吳軍正20060501第口軍區(qū)土學(xué)博士學(xué)馕論文縮略語BPBSACDNADABDEPCDMSODMEMDSRNAEBECMEDTAFBSFCMFITCFNHEHRPKDLBM哐CMM~姍MMP2縮略語表英文全稱中文全稱BASEPAIR堿基對BOVINCSEMMALBUMM牛血清白蛋白COMPLEMENTARYDNA互補(bǔ)DNADI鋤INOBELLZIDINE二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽TE廿AHYDROCLLLORIDEDIETLLYLPYROC如ONATE二乙基焦磷酰胺DIMENLYLSUIFOXIDE二甲基亞砜DULBECCO’SMODI丘EDEA酎E改良EAGLE培養(yǎng)基DULBECCOMEDIUMDOUBLES昀NDRNA雙鏈融叮AETLIDI啪BROLNIDE溴化乙錠EXTRACELLLLLARMATRIX細(xì)胞外基質(zhì)EⅡ1YLENEDI鋤INETETRAACETIC乙二胺四乙酸二鈉ACIDFETALBOVIILESENLIN胎牛血清FLOWCYTOME虹Y流式細(xì)胞儀FLUORESCEINISOTLLIOCYLLATE異硫氰酸熒光素FIBRONECTIN纖粘連蛋白HEMATOXYLILLEOSIN蘇木素一伊紅HORSERADISHPEROXIDASE辣根過氧化物酶KILODALTON千道爾頓L嘶ABENALLIMEDI啪LB培養(yǎng)基MUCOEPIDENNOIDCARCINOMA粘液表皮樣癌MINUTE分鐘M枷XMETALLOPROTEMASE基質(zhì)金屬蛋白酶MATRIXMETALL叩ROTEINASE2基質(zhì)金屬蛋白酶2明膠酶A
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    • 簡介:RNARNARNARNA干擾抑制干擾抑制干擾抑制干擾抑制KATOIIIKATOIIIKATOIIIKATOIIICD133CD133CD133CD133胃癌細(xì)胞胃癌細(xì)胞胃癌細(xì)胞胃癌細(xì)胞CD133CD133CD133CD133基因表達(dá)基因表達(dá)基因表達(dá)基因表達(dá)及及及及對對對對其生物學(xué)特性其生物學(xué)特性其生物學(xué)特性其生物學(xué)特性的影響的影響的影響的影響EFFECTEFFECTEFFECTEFFECTOFOFOFOFRNAIRNAIRNAIRNAIINHIBITIONINHIBITIONINHIBITIONINHIBITIONTOTOTOTOEXPRESSIONEXPRESSIONEXPRESSIONEXPRESSIONOFOFOFOFCD133CD133CD133CD133ONONONONTUMTUMTUMTUMCELLCELLCELLCELLBIOLOGICALBIOLOGICALBIOLOGICALBIOLOGICALACTERISTICSACTERISTICSACTERISTICSACTERISTICSININININKATOKATOKATOKATOIIIIIIIIIIIICD133CD133CD133CD133CELLSCELLSCELLSCELLSOFOFOFOFHUMANHUMANHUMANHUMANGASTRICGASTRICGASTRICGASTRICCANCERCANCERCANCERCANCER論文類別學(xué)術(shù)研究型論文類別學(xué)術(shù)研究型作者姓名王守練王守練指導(dǎo)教師姓名指導(dǎo)教師姓名姜波健姜波健教授教授申請學(xué)位級別申請學(xué)位級別碩士學(xué)位授予單位學(xué)位授予單位蚌埠醫(yī)學(xué)院蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)科專業(yè)外科學(xué)外科學(xué)研究方向胃腸道腫瘤胃腸道腫瘤論文答辯時間論文答辯時間20132013年5月學(xué)位授予日期學(xué)位授予日期20132013年6月答辯委員會主席答辯委員會主席論文評閱人20132013年5月分類號密級學(xué)校代碼11110000333366667777UDC編號學(xué)號20109031119201090311192010903111920109031119學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明本人所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立進(jìn)行實驗研究工作所取得的成果,本論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或已經(jīng)獲取得的研究成果。在本論文撰寫中所引用其他研究者的研究內(nèi)容和成果時已在論文中給予特別標(biāo)注和明確說明。對本論文的實驗研究以及論文撰寫過程中給予幫助和建議等貢獻(xiàn)的其他人士,也已作了致謝說明。本人完全理解本聲明的法律責(zé)任,以及所涉及的結(jié)果將由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名日期年月日關(guān)于學(xué)位論文著作權(quán)的共享聲明根據(jù)中華人民共和國著作權(quán)法和高等院校知識產(chǎn)權(quán)管理條例,本學(xué)位論文,題目,是研究生在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的職務(wù)作品,得到蚌埠醫(yī)學(xué)院相關(guān)部門科室的物質(zhì)技術(shù)和經(jīng)費支持,因此,本學(xué)位論文的著作權(quán)由研究生,導(dǎo)師和蚌埠醫(yī)學(xué)院三方共同享有,均享有署名權(quán)和使用權(quán)等權(quán)益;本學(xué)位論文成果歸屬蚌埠醫(yī)學(xué)院。根據(jù)國家學(xué)位授予條例,學(xué)校對本學(xué)位論文有使用權(quán),包括保存本學(xué)位論文;因教學(xué)和科研的目的,保留在圖書館被查閱或借閱;學(xué)??筛鶕?jù)國家規(guī)定將本學(xué)位論文送交國家有部門保留和使用。學(xué)校在公布本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容時,應(yīng)保障研究生和導(dǎo)師的署名權(quán)等權(quán)益。研究生和導(dǎo)師在公開發(fā)表本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容時必須保障學(xué)校的署名權(quán)等權(quán)益,即在發(fā)表論文時蚌埠醫(yī)學(xué)院及相關(guān)部門科室應(yīng)署名為作者單位。聲明人完全理解本聲明的法律責(zé)任。研究生簽名導(dǎo)師簽名日期年月日
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    • 簡介:近年來的研究發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)及創(chuàng)傷修復(fù)中具有重要作用,并已顯示出良好的治療前景。目前對口腔粘膜上皮干細(xì)胞的研究已經(jīng)開展,但對其生物學(xué)特性研究尚缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識;而對口腔粘膜固有層細(xì)胞的研究比較少見,尤其是口腔粘膜固有層干細(xì)胞的研究更是未見相關(guān)報道?;诳谇徽衬づc皮膚類似,在維持正常組織結(jié)構(gòu)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用,以及皮膚源性上皮干細(xì)胞和真皮組織干細(xì)胞的研究進(jìn)展,因而在口腔粘膜中也應(yīng)含有類似的成體干細(xì)胞?,F(xiàn)代創(chuàng)傷修復(fù)理論認(rèn)為在創(chuàng)傷愈合的過程中,不同的細(xì)胞成分被微環(huán)境激活,參與組織修復(fù)。而且體內(nèi)局部組織特異性的微環(huán)境也決定了干細(xì)胞的可塑性。目前,成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、治療性克隆以及以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程TISSUEENGINEERING,TE技術(shù)的發(fā)展,為創(chuàng)傷修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的研究提供了重要的線索和途徑。但是,在目前研究中合適的種子細(xì)胞應(yīng)用,尤其是自體細(xì)胞的應(yīng)用尚存在如細(xì)胞體外擴(kuò)增能力低及取材困難等難題??谇徽衬と〔南鄬﹄[蔽,且預(yù)后不留瘢痕,有望成為細(xì)胞移植、基因治療和組織工程中自體成體干細(xì)胞的一個新來源??谇徽衬じ杉?xì)胞的研究不僅可進(jìn)一步明確口腔粘膜的生物學(xué)特點,而且由于其自身特點,可以做為種子細(xì)胞,在自體皮膚缺損尤其是大面積缺損以及受損角膜等組織的修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景。本研究分離培養(yǎng)口腔粘膜干細(xì)胞,并觀察口腔粘膜干細(xì)胞的生物學(xué)行為;然后應(yīng)用組織工程技術(shù),構(gòu)建TE膜片,修復(fù)組織缺損,其中包括病損皮膚及眼角膜的修復(fù)觀察。為將來口腔粘膜源性干細(xì)胞在皮膚及眼角膜病損等組織的修復(fù)應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。實驗主要包括以下內(nèi)容1、口腔粘膜干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)性狀研究,以兔口腔粘膜為試驗對象,包括口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察,以及口腔粘膜上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察。1口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的檢測。利用貼壁篩選方法,白兔口腔粘膜固有層中篩選出具有克隆性生長的細(xì)胞,利用間充質(zhì)干細(xì)胞相對特異表面標(biāo)識物CD44等加以鑒定,確定所分離細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞;然后采用低密度連續(xù)稀釋法獲得兔口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞克隆,MTT方法檢測細(xì)胞的增殖,明確其生長曲線;細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示約951%細(xì)胞處于G0G1期;并在成軟骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞特異性誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng),誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、神經(jīng)細(xì)胞NSE和S100染色和脂肪細(xì)胞脂滴合成和油紅O染色特異性的標(biāo)志物,提示細(xì)胞具有多向分化潛能,支持篩選的細(xì)胞克隆為成體干細(xì)胞。結(jié)果證明口腔粘膜固有層中含有具有多向分化潛能的固有層間充質(zhì)干細(xì)胞,并能在大量體外擴(kuò)增培養(yǎng)。2口腔粘膜上皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性檢測。利用上皮干細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的快速黏附性,對口腔粘膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行篩選,同時利用上皮干細(xì)胞相對特異標(biāo)識物Β1整合素及CK19加以鑒定。結(jié)果表明篩選細(xì)胞在體外呈克隆性生長,流式細(xì)胞儀檢測表明上皮干細(xì)胞G0G1期細(xì)胞所占比例為904%;Β1整合素及CK19陽性表達(dá),顯示所篩選細(xì)胞為上皮干細(xì)胞。本部分實驗結(jié)果首次證明在口腔粘膜固有層中含有成體干細(xì)胞,具有多向分化潛能,并可在體外大量擴(kuò)增;而口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增。本部分獲得處于良好生長狀態(tài)的口腔粘膜干細(xì)胞,為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。2、口腔粘膜干細(xì)胞應(yīng)用于TE膜片的構(gòu)建,其中包括3部分,分別是TE上皮膜片的構(gòu)建、TE基質(zhì)膜片的構(gòu)建、雙層TE膜片的構(gòu)建。1構(gòu)建TE上皮膜片。用本實驗室設(shè)計的組織工程皮膚培養(yǎng)系統(tǒng),以口腔粘膜上皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞,分別以膠原膜及脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為支架,體外構(gòu)建TE上皮膜片,培養(yǎng)取材,常規(guī)HE染色檢測,并同時利用CK10上皮角化特異標(biāo)識物、CK19及Β1整合素檢測。結(jié)果顯示口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在膠原膜及脫細(xì)胞支架上形成無角化的上皮結(jié)構(gòu),并且底層存在上皮干細(xì)胞。表明口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在體外成功構(gòu)建TE上皮膜片,同時仍保留一定的上皮干細(xì)胞,可能更有利于損傷部位結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)。2構(gòu)建TE基質(zhì)膜片。首先以固有層間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞,與膠原凝膠混合構(gòu)建TE基質(zhì)膜片,同時以固有層成纖維細(xì)胞為對照組;HE結(jié)果顯示,10D時固有層間充質(zhì)干細(xì)胞組在細(xì)胞數(shù)量上比對照組多,這種數(shù)量上的差異可能在創(chuàng)傷修復(fù)中將起到重要作用。然后,以固有層間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)膜片上構(gòu)建TE基質(zhì)膜片,同時以兔角膜基質(zhì)細(xì)胞為對照。HE染色觀察,并進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果顯示固有層間充質(zhì)干細(xì)胞在材料上生長狀態(tài)良好;表明可在體外形成TE基質(zhì)膜片,為口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞在缺損修復(fù)中的應(yīng)用提供了可靠的實驗條件。3構(gòu)建雙層TE膜片。共分為5組,包括A組固有層間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞;B組固有層間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞上皮細(xì)胞;C組固有層成纖維細(xì)胞和上皮干細(xì)胞;D組固有層成纖維細(xì)胞和上皮干細(xì)胞上皮細(xì)胞;E組皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚表皮細(xì)胞對照組;以膠原凝膠為支架,構(gòu)建含兩種不同類型細(xì)胞的雙層TE膜片。通過HE染色、免疫組織化學(xué)方法對TE膜片進(jìn)行檢測,觀察構(gòu)建的異同。結(jié)果顯示利用上皮干細(xì)胞可形成角化上皮,且仍有大量上皮干細(xì)胞的存在,形成基底層;混合上皮干細(xì)胞上皮細(xì)胞,構(gòu)建的TE膜片中上皮層明顯多于其它組,且有基底層的形成及上皮干細(xì)胞的存在,可能原因在于混合組的細(xì)胞形成微環(huán)境,更適于上皮干細(xì)胞的分化增殖,同時也促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖。本部分結(jié)果表明,兔口腔粘膜干細(xì)胞可以作為種子細(xì)胞,在不同支架材料上可以在體外成功構(gòu)建TE膜片,為將來應(yīng)用于缺損修復(fù)奠定一定的基礎(chǔ)。3、口腔粘膜干細(xì)胞構(gòu)建TE膜片應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù),在第2部分成功構(gòu)建TE膜片基礎(chǔ)上,選擇三種不同損傷模型包括全層皮膚缺損、角膜潰瘍以及角膜緣干細(xì)胞缺損,對兩種不同組織,包括皮膚角化和角膜無角化進(jìn)行修復(fù),探討口腔粘膜上皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,在不同種類的受損上皮組織修復(fù)中的作用;同時探討口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在不同受損類型中修復(fù)真皮層及基質(zhì)層中的作用。1全層皮膚缺損模型的修復(fù)。以體外構(gòu)建的雙層TE膜片修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損,30D后取材,HE檢測。結(jié)果證明由兩種口腔粘膜干細(xì)胞所構(gòu)建的TE膜片修復(fù)裸鼠的皮膚缺損,形成的皮膚結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞狀態(tài)良好,可以成功修復(fù)并有大量真皮微血管長入,具有更好的修復(fù)效果。2兔角膜潰瘍模型的修復(fù)。以熒光染料PKH26標(biāo)記口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞,將其接種在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上,構(gòu)建TE基質(zhì)膜片。術(shù)后進(jìn)行大體及HE染色觀察、熒光顯微鏡觀察。結(jié)果表明TE基質(zhì)膜片移植后,可以修復(fù)角膜潰瘍,熒光觀察結(jié)果表明固有層間充質(zhì)干細(xì)胞8周時依然存在,說明其參與角膜基質(zhì)的修復(fù)重建,本實驗首次證明口腔粘膜來源的固有層間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)角膜基質(zhì)的損傷。3角膜緣干細(xì)胞缺損的修復(fù)。利用兔口腔粘膜上皮干細(xì)胞以脫細(xì)胞基質(zhì)材料為支架構(gòu)建的TE上皮膜片,進(jìn)行自體角膜干細(xì)胞缺損模型的修復(fù),術(shù)后進(jìn)行大體及HE染色觀察。結(jié)果表明可以修復(fù)角膜干細(xì)胞缺損,為角膜提供穩(wěn)定的上皮來源,阻止新生血管入侵,恢復(fù)角膜透明性,使眼表健康重建;同時表明創(chuàng)傷局部微環(huán)境是口腔粘膜上皮干細(xì)胞替代角膜干細(xì)胞,參與角膜組織修復(fù)的生物學(xué)基礎(chǔ)。本部分利用口腔粘膜干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,應(yīng)用于非口腔粘膜類組織損傷的修復(fù);結(jié)果表明口腔粘膜上皮干細(xì)胞及固有層間充質(zhì)干細(xì)胞可以在不同微環(huán)境中,分化為所在部位的細(xì)胞,參與修復(fù)損傷;證明口腔粘膜可以作為一種成體干細(xì)胞的可靠來源,在創(chuàng)傷修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景,尤其在自體干細(xì)胞治療中具有重要意義。
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    • 簡介:四川大學(xué)博士后學(xué)位論文體外培養(yǎng)小鼠牙髓干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其生物學(xué)特性的研究姓名陸群申請學(xué)位級別博士后專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)牙體牙髓病指導(dǎo)教師周學(xué)東吳補(bǔ)領(lǐng)20040501蘭些堡壘蘭型呈絲竺一體外培養(yǎng)小鼠牙髓干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其生物學(xué)特性的研究摘要博士后陸群合作導(dǎo)師周學(xué)東教授吳補(bǔ)領(lǐng)教授干細(xì)胞有自我更新、多向分化潛能,不僅有著廣闊的運(yùn)用前景,而且對在細(xì)胞和分子水平認(rèn)識組織的發(fā)育機(jī)制、損傷修復(fù)機(jī)理有著重要的研究價值。牙髓干細(xì)胞的研究是目前牙髓生物學(xué)領(lǐng)域一個嶄新的課題,它對認(rèn)識牙髓損傷修復(fù)機(jī)理、探索新的保存牙髓治療技術(shù)具有重要的意義。成體組織干細(xì)胞在體內(nèi)含量極少,需要體外培養(yǎng)擴(kuò)增。本研究著眼于小鼠牙髓干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定,比較二者細(xì)胞生物學(xué)特性,為牙齒再造提供充足的細(xì)胞來源。此外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞體外定向分化,并初步探討NOTCH信號在牙髓千細(xì)胞的生物學(xué)功能。實驗采用①酶消化培養(yǎng)法培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞。牙髓組織消化獲得單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為L104/孔細(xì)胞,接種于六孔板,用200MLL1胎牛血清的。一MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)14D,挑出細(xì)胞克隆消化傳代,繪制細(xì)胞生長曲線,計算細(xì)胞集落形成率。電鏡觀察牙髓干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。②細(xì)胞因子TGFP、腳P、FGF誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞定向分化,PCR技術(shù)檢測牙本質(zhì)特異性蛋白DSPP的MRNA的表達(dá)。③PERCOLL密度分離法結(jié)合貼壁法培養(yǎng)、擴(kuò)增、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMMSCS,流式細(xì)胞儀檢測BMMSCS表面特異性抗原,免疫組化鑒定BMMSCS細(xì)胞表型。④比較牙髓干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多次細(xì)胞傳代,細(xì)胞的增殖力及克隆形成力的生物學(xué)特性改變。⑤RTPCR檢測鼠的牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞間信號分子NOTCH基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)①小鼠牙髓細(xì)胞呈集落狀生長,克隆形成率為162J/I04細(xì)胞,所形成的集落細(xì)胞結(jié)合緊密,細(xì)胞體積小、胞核大。HE染色,見細(xì)胞有體小、核大的特點,有較多的雙核細(xì)胞,細(xì)胞間的界限不清。電鏡觀察牙髓干細(xì)胞間存在細(xì)胞間連接。②挑出小鼠牙髓細(xì)胞的細(xì)胞克隆消化傳代,細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)8天,PCR檢測表達(dá)有DSPPMRNA。③原代培養(yǎng)的BMMSCS在體外擴(kuò)增獲得810‘個細(xì)胞個細(xì)胞,體外擴(kuò)增5代后可獲得1410‘個細(xì)胞,體外擴(kuò)增LO代后,可獲得4810”個細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢532
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    • 簡介:目的探討日本血吸蟲染色體制備和細(xì)胞體外培養(yǎng)條件并分析培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性方法1采用20ΜGML的秋水仙素處理童蟲制備染色體標(biāo)本并進(jìn)行G帶顯帶然后對其染色體核型及G帶帶型進(jìn)行分析2選取5種促進(jìn)細(xì)胞增殖的因子采用正交設(shè)計配制16種條件培養(yǎng)基對18DSJ童蟲細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)比較觀察細(xì)胞的增殖能力直觀分析細(xì)胞AKP的檢測結(jié)果3用改良RPMI1640培基對SJ尾蚴細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)用HE染色和掃描電鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)用SDSPAGE和ELISA法分析其抗原組分用免疫熒光法和凝集試驗檢測其抗原性結(jié)果1日本血吸蟲染色體2N162號為性染色體核型公式為2N6ST8SM2M各對染色體均顯示出各自特征性G帶帶型2對組織細(xì)胞增殖相觀察和AKP%的直觀分析結(jié)果表明促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳組合為轉(zhuǎn)鐵蛋白單核苷酸和BFGF3尾蚴細(xì)胞形態(tài)觀察表明其平均大小為35ΜM直徑最小僅1ΜM直徑HE染色后細(xì)胞呈高核質(zhì)比率少數(shù)胞漿較豐富掃描電鏡下有的細(xì)胞表面布滿細(xì)小微絨毛有的呈乳突樣突起凹窩及小孔有的胞質(zhì)形成皺折和突起原代與傳代培養(yǎng)細(xì)胞抗原組分存在差異其傳代細(xì)胞能與抗尾蚴血清發(fā)生特異性反應(yīng)結(jié)論1為血吸蟲培養(yǎng)細(xì)胞鑒定提供了染色體核型及其G帶帶型分析的方法2證明轉(zhuǎn)鐵蛋白核苷酸和BFGF對SJ童蟲細(xì)胞增殖具有明顯促進(jìn)作用3對SJ尾蚴細(xì)胞培養(yǎng)獲得傳代結(jié)果并初步鑒定了培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征證明尾蚴傳代細(xì)胞具有免疫學(xué)應(yīng)用價值
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    • 簡介:1分類號密級UCD編號博士學(xué)位論文ATRA及其衍生物對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究THEEFFECTOFATRAATPRONCOLECTALCANCERCELLITSPOSSIBLEMOLECULARMECHANISMS左莉指導(dǎo)教師姓名汪淵教授安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)中心實驗室魏偉教授安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所申請學(xué)位級別博士專業(yè)名稱藥理學(xué)提交論文日期2014315論文答辯日期2014515學(xué)位授予單位和日期安徽醫(yī)科大學(xué)答辯委員會主席章孝榮教授評閱人李少林教授等2014年2月安徽醫(yī)科大學(xué)博士論文左莉2014
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    • 簡介:第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化及基本生物學(xué)特性研究目的探討從人臍帶組織分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞MSC的方法,并對獲取的MSC進(jìn)行擴(kuò)增、純化,研究其基本生物學(xué)特性。方法無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,以20ML注射器分別插入兩根臍靜脈及一跟臍動脈內(nèi),反復(fù)沖洗,沖去血管內(nèi)的殘存積血。組織剪將臍帶剪碎,直至1MM3大小組織塊。直接將組織塊接種于含DMEMF12培養(yǎng)基或?qū)⒔M織塊經(jīng)酶消化法獲取單個核細(xì)胞后接種于DMEMF12培養(yǎng)基。進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察并記錄其形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時,消化傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測MSC的細(xì)胞表面標(biāo)志。繪制細(xì)胞生長曲線,通過5溴脫氧尿嘧啶核苷BRDU摻入實驗檢測其增殖能力。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。RTPCR檢測OCT4MRNA表達(dá)。透射電鏡觀察臍帶MSC的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果兩種分離方法均可獲得成纖維樣細(xì)胞。組織塊貼壁法1周后于組織塊間隙已可見散在分布的長條索狀紡錘型細(xì)胞,3周左右細(xì)胞達(dá)到80%融合。膠原酶消化法,細(xì)胞接種后第2天即可見有少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞,散在分布,1周左右時,貼壁細(xì)胞形成集落,占優(yōu)勢的是成纖維樣細(xì)胞,及少量鵝卵石樣細(xì)胞,至2周左右可達(dá)到80%融合。經(jīng)傳代培養(yǎng)后,可得到較為純化的成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞約每3天即可達(dá)到90%~95%融合,需再次傳代或凍存,細(xì)胞可傳代20代以上。分別對第3代、第5代、第10代臍帶MSC行FACS檢測,結(jié)果表明各代間免疫表型無明顯差異,均強(qiáng)烈表達(dá)CD13、CD29、CD105、CD44,弱表達(dá)CD106,不表達(dá)CD14、CD34、CD11A、CD31、CD45。對第2、6、12代UCMSCS生長曲線進(jìn)行分析,表明其倍增時間分別為331H、344H、3465H。BRDU摻入實驗中,培養(yǎng)液中加入BRDU后48小時,免疫組織化學(xué)染色顯示80%~90%細(xì)胞BRDU表達(dá)陽性。流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測表明,UCMSCS有80%~90%細(xì)胞處于G0G1期。RTPCR檢測示臍帶MSCOCT4MRNA表達(dá)陽性。透射電鏡觀察顯示臍帶MSC核大,不規(guī)則,核仁明顯,常染色質(zhì)多,異染色質(zhì)少;胞漿少,內(nèi)有少量細(xì)胞器,以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體為主,胞漿內(nèi)有較多游離核糖體。結(jié)論組織快貼壁法和膠原酶消化法均可從臍帶組織提取到成纖維樣細(xì)胞。該細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力,且具有不成熟的細(xì)胞核及胞漿內(nèi)的超微結(jié)構(gòu),OCT4表達(dá)陽性,顯示其具有干細(xì)胞特性。細(xì)胞表面分子檢測顯示該臍帶來源干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志與骨髓MSC相同,是間充質(zhì)干細(xì)胞的新成員。作為從分娩廢棄物臍帶組織中提取到的干細(xì)胞,UCMSCS無倫理學(xué)限制,取材方便,為干細(xì)胞的研究及臨床應(yīng)用鋪平了道路。第二部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究目的探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELLS,MSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的條件及方法,以明確其神經(jīng)分化潛能,進(jìn)而為臍帶MSC的神經(jīng)移植提供理論依據(jù)。方法取第3,5,10代的MSC分別用三種不同的誘導(dǎo)方法向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)。化學(xué)試劑誘導(dǎo)法首先將細(xì)胞置于預(yù)誘導(dǎo)液DMEMF1220%FBS10NGMLBFGF進(jìn)行培養(yǎng),24小時后去掉預(yù)誘導(dǎo)液,更換為誘導(dǎo)液DMEMF122%DMSO200ΜMBHA25ΜMKCL2MM丙戊酸10ΜM拂司扣林1ΜM氫化可的松,誘導(dǎo)5小時。丹參誘導(dǎo)法用同樣方法預(yù)誘導(dǎo)24小時后,更換為DMEMF122%丹參注射液繼續(xù)誘導(dǎo)5小時。神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)法于培養(yǎng)基中添加BFGF20NGML,EGF20NGML,全反式維甲酸RA05ΜM,在37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)7天。誘導(dǎo)期間觀察細(xì)胞形態(tài)變化,誘導(dǎo)結(jié)束后,4%多聚甲醛固定細(xì)胞,分別用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測神經(jīng)元樣細(xì)胞特異性標(biāo)志物NESTIN,NSE,NEUN,NFM,ΒTUBULINⅢ,GFAP表達(dá)。比較不同代數(shù)UCMSCS神經(jīng)分化能力的差異。用RTPCR法檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)前后UCMSCS表達(dá)NSE、GFAPMRNA的差異。結(jié)果化學(xué)誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑后051小時,UCMSCS即已出現(xiàn)形態(tài)變化,隨誘導(dǎo)時間延長,細(xì)胞形態(tài)變化愈加明顯,胞體伸出長長的突起,表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞樣改變。多個細(xì)胞的突起有時相互連接形成網(wǎng)狀,類似樹突樣結(jié)構(gòu)。然而810小時后,部分細(xì)胞死亡,胞體漂浮。丹參誘導(dǎo)組加入丹參注射液后,部分細(xì)胞胞漿收縮,伸出突起,表現(xiàn)為神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài),但細(xì)胞形態(tài)變化緩和,不如化學(xué)誘導(dǎo)組明顯。神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)組,隨時間延長,胞體漸拉長,有部分細(xì)胞逐漸形成絲狀突起,細(xì)胞生長狀態(tài)良好,無明顯細(xì)胞漂浮或死亡現(xiàn)象。免疫組化法檢測顯示不同代數(shù)的UCMSCS經(jīng)化學(xué)試劑誘導(dǎo)后均表達(dá)NESTIN,NSE,NEUN,NFM,不表達(dá)GFAP。免疫熒光檢測顯示不同代數(shù)的UCMSCS經(jīng)丹參誘導(dǎo)后均表達(dá)NESTIN,NSE,NFM,ΒTUBULINⅢ,并有少量細(xì)胞表達(dá)GFAP。神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)組同樣顯示大量細(xì)胞NESTIN,NSE,NFM,ΒTUBULINⅢ表達(dá)陽性,并有少量細(xì)胞表達(dá)GFAP。RTPCR顯示神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)前后NSEMRNA均有表達(dá),但誘導(dǎo)后表達(dá)增加。GFAP則無論在誘導(dǎo)前后均未見表達(dá)。OCT4MRNA表達(dá)在誘導(dǎo)后消失。結(jié)論UCMSCS經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)法、中藥誘導(dǎo)法、神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)法均可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物。表明UCMSCS具有神經(jīng)分化潛能。本研究為UCMSCS神經(jīng)移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病鋪平了道路。第三部分人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)移植治療大鼠液壓沖擊腦損傷的實驗研究目的觀察人UCMSCS移植到正常大鼠腦組織移植后的存活、遷移及分化情況,并探討人UCMSCS腦內(nèi)移植對大鼠液壓沖擊腦損傷的治療作用及其機(jī)制。方法1、取生長狀況良好貼壁培養(yǎng)第6代以內(nèi)的人UCMSCS,分別用5溴脫氧鳥嘧啶核苷BRDU或BISBENZIEHOECHST33258標(biāo)記細(xì)胞。2、微量注射泵以1ΜLMIN的速度向正常大鼠海馬CA1段注入10ΜL標(biāo)記的人UCMSCS細(xì)胞懸液1106個,DF12混懸,細(xì)胞移植結(jié)束后根據(jù)動物不同分組分別于移植后1周、2周、4周、6周時處死動物,4%多聚甲醛灌注取材。于注射點部位冠狀切開,連續(xù)切片觀察移植細(xì)胞在腦組織內(nèi)的分布。行免疫組織化學(xué)檢測移植細(xì)胞NSE,GFAP,NFM的表達(dá)情況。3、制作大鼠液壓沖擊腦損傷模型。傷后24小時,向損傷灶周邊立體定向注入10ULBRDU標(biāo)記的UCMSCS細(xì)胞懸液1106個,DF12混懸,并設(shè)對照。分別于顱腦損傷前、傷后24小時、傷后48小時、傷后1周、2周、3周、4周對動物進(jìn)行神經(jīng)運(yùn)動功能進(jìn)行評分。顱腦損傷后4周,處死動物并取材,于細(xì)胞移植位點連續(xù)冠狀切片,行BRDU免疫組織化學(xué)染色,并取BRDU陽性細(xì)胞相鄰切片分別行免疫組織化學(xué)染色觀察移植細(xì)胞NSE、GFAP的表達(dá),細(xì)胞移植區(qū)域VEGF的表達(dá)。行FITCBEIRAEASIMPLICIFOLIALECTIN1FITCBSLECTIN1染色觀察損傷區(qū)微血管數(shù)量的變化。行TUNEL法原位標(biāo)記損傷區(qū)域凋亡細(xì)胞。結(jié)果1、正常大鼠海馬C1段移植UCMSC后,移植細(xì)胞至少可存活6周以上,向注射點臨近腦組織移行超過1MM,并向遠(yuǎn)隔部位如室管膜下區(qū)遷移;免疫組織化學(xué)檢測表明部分移植細(xì)胞表達(dá)NSE、NF、GFAP。2、大鼠液壓沖擊腦損傷后13周,TBIUCMSCS移植組神經(jīng)運(yùn)動功功能評分顯著高于TBIDF組、TBI組P<005,損傷后4周,各組神經(jīng)運(yùn)動功較能評分均回復(fù)正常,組間無明顯差別F13,P>01。3、免疫組織化學(xué)檢查顯示部分移植細(xì)胞分別表達(dá)NSE、NF、GFAP。UCMSC移植組創(chuàng)傷區(qū)VEGF表達(dá)較對照組明顯增多。FITCBSLECTIN1染色示UCMSC移植組創(chuàng)傷區(qū)皮層微血管密度明顯高于對照組。原位調(diào)亡染色顯示UCMSC移植組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組。結(jié)論人UCMSC大鼠腦組織內(nèi)移植后可長期存活,向室管膜下區(qū)遷移并有部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。臍帶間質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)移植有助于促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷后的早期功能恢復(fù),這種治療效果是通過刺激宿主細(xì)胞分泌VEGF,增加損傷區(qū)微血管密度,抑制宿主細(xì)胞凋亡等實現(xiàn)的。
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