microRNA-185負向調(diào)控雄激素受體抑制前列腺癌細胞腫瘤生物學(xué)特性的作用機制研究.pdf

1、前列腺癌(canccrofprostate)是歐美國家最常見的惡性腫瘤之一，占第二位。在美國，前列腺癌的發(fā)病率占首位，死亡率僅次于肺癌。中國等亞洲國家前列腺癌遠低于歐美，但是其發(fā)病率呈現(xiàn)顯著增長的趨勢。前列腺癌的病因至今尚未闡明，激素假說獲得了較為廣泛的支持。前列腺的生長依賴雄激素的作用，前列腺癌細胞的增殖也有賴于雄激素的生物學(xué)作用。因此，目前對于前列腺癌的治療措施中除根治性前列腺癌切除術(shù)等手術(shù)治療外，最大阻斷雄激素(MAB)為最主要的

2、方法，即手術(shù)切除睪丸+氟他胺+促黃體激素釋放激素促效劑(LHRH-A)聯(lián)合應(yīng)用，以期達到雄激素的最大阻斷，從而抑制前列腺癌細胞的增長。
　　 盡管MAB能夠達到很好的抑制前列腺癌細胞生長的目的，仍有部分前列腺癌會進展為另一階段：激素非依賴性前列腺癌。激素非依賴性前列腺癌不依賴雄激素的生物學(xué)作用，在此階段前列腺癌細胞的生長通過其他方式增殖、遷移和侵襲。由激素依賴性前列腺癌進展為激素非依賴性前列腺癌的具體機制尚未闡明，目前主要存在四

3、種觀點：雄激素受體表達上調(diào)、雄激素受體基因突變、配體非依賴性激活和共調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。由此可見，雄激素受體在前列腺癌的進展過程中發(fā)揮著重要的作用。雄激素作用的發(fā)揮主要是通過與雄激素受體結(jié)合來啟動下游信號通路。雄激素受體信號通路的下游分子多種多樣，其生物學(xué)功能涉及細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡等等。最常見的例子便是其下游分子PSA的高表達可以促使前列腺細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體參與了前列腺癌的進展過程，因此如果能夠采取干預(yù)措施抑制雄激

4、素受體的生物學(xué)作用，則可以有效抑制前列腺癌的發(fā)展。進一步講，通過有效干預(yù)雄激素受體的功能，有助于抑制前列腺癌由激素依賴性前列腺癌進展為激素非依賴性前列腺癌。
　　 MicroRNAs為內(nèi)源性、非編碼性的小的核苷酸片段，長度一般為22～25nt。近年來，有關(guān)microRNA對細胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點。MicroRNAs能夠與mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合，從而阻遏mRNA的翻譯功能，甚至直接降解mRNA，這兩方面

5、作用都能夠抑制蛋白的合成，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，可以表現(xiàn)為癌基因發(fā)揮促進腫瘤的作用，也可以表現(xiàn)為抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤的作用。由此可見，如若采取相應(yīng)的干預(yù)手段上調(diào)或者下調(diào)相應(yīng)microRNAs的水平，可以達到抑制腫瘤生長的目的。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-185(縮寫為miR-185)在諸多腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用，例如直腸癌、卵巢癌等

6、等，但是有關(guān)其在前列腺癌中的作用至今未見報道。鑒于雄激素受體在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展和激素非依賴性前列腺癌的進展過程中發(fā)揮著重要的作用，我們擬研究miR-185與雄激素受體是否存在相應(yīng)的調(diào)控關(guān)系以及miR-185是否能夠干預(yù)前列腺癌細胞的生長。
　　 一、miR-185在臨床PCa組織中的低表達以及靶點預(yù)測和靶點驗證
　　 我們首先檢測了miR-185在臨床前列腺癌標本和癌旁正常組織中的表達情況。首先，microRNA芯片分

7、析發(fā)現(xiàn)miR-185在前列腺癌組織中呈現(xiàn)低表達。然后取前列腺癌和前列腺癌旁正常組織各25例，部分凍存，部分用中性福爾馬林固定。病理切片HE染色證實所取組織為前列腺癌或正常前列腺上皮組織。凍存標本經(jīng)RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄擴增和qRT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-185在前列腺癌組織中的表達量顯著低于癌旁正常組織。這一結(jié)果提示miR-185可能參與了前列腺癌的腫瘤發(fā)展過程。在此基礎(chǔ)上，我們利用TargetScan5.2algorithm(www

8、.targetscan.org)預(yù)測miR-185的作用靶點。結(jié)果令人興奮的是，雄激素受體的3’UTR存在miR-185的潛在作用靶點，其作用位點為173-179nt。之后，我們利用雙熒光報告載體，驗證了miR-185與雄激素受體的靶向作用關(guān)系，結(jié)果證實miR-185確實能夠結(jié)合雄激素受體的3’UTR區(qū)，導(dǎo)致熒光強度的降低，從而證實了預(yù)測結(jié)果?；瘜W(xué)合成miR-185mimics(miR-185m)和對照microRNAnegativec

9、ontrol(miR-NC)，利用INTERFERin將化學(xué)合成物轉(zhuǎn)染入LNCaP細胞，之后檢測雄激素受體AR和前列腺特異性抗原PSA的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-185m促使AR蛋白的表達顯著降低。同時，PSA的表達也顯著降低，表現(xiàn)在mRNA和蛋白兩個水平。上述結(jié)果從基因和蛋白水平證實了miR-185對雄激素受體的靶向作用。
　　 二、miR-185高表達對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　 在本部分實驗中，

10、我們重點研究miR-185對前列腺癌細胞腫瘤生物學(xué)特性的影響。我們選擇了雄激素受體表達強陽性的LNCaP細胞株作為研究對象。首先進行細胞的培養(yǎng)、傳代，其中總結(jié)了關(guān)于LNCaP培養(yǎng)過程中的經(jīng)驗。之后化學(xué)合成miR-185mimics(miR-185m)和對照microRNAnegativecontrol(miR-NC)，利用轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin將化學(xué)合成物轉(zhuǎn)染入LNCaP細胞。PCR證實轉(zhuǎn)染效率足夠研究要求。在細胞增殖實驗中，利用

11、日本同仁化學(xué)研究所的CCK-8試劑盒，連續(xù)檢測測轉(zhuǎn)染后5天的LNCaP細胞生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-185m后LNCaP細胞的增殖受到顯著抑制。在細胞遷移實驗中，我們采用劃痕實驗證實轉(zhuǎn)染miR-185m顯著削弱了LNCaP細胞的腫瘤遷移能力。在細胞侵襲實驗中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-185m后，穿過8微米細孔的LNCaP細胞顯著減少，提示其腫瘤侵襲能力顯著降低。為探求miR-185對LNCaP細胞周期的影響，我們利用流式細胞檢測技術(shù)檢

12、測了轉(zhuǎn)染miR-185m后細胞各周期的的比率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-185m后細胞被阻滯在G1期，S期的細胞數(shù)量顯著減少，說明miR-185能夠起到G1/S阻滯的作用。上述研究證實：miR-185能夠抑制前列腺癌細胞的增殖，主要是通過細胞周期G1/S阻滯實現(xiàn)；miR-185能夠減弱前列腺癌細胞遷移和侵襲的能力，提示其顯著的腫瘤抑制作用。
　　 三、miR-185高表達對裸鼠皮下前列腺癌腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響
　　 在本部分實

13、驗中，我們重點研究經(jīng)miR-185m轉(zhuǎn)染的LNCaP細胞在裸鼠體內(nèi)的生長情況。為使得轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定傳代，我們將miR-185m進行2'ome修飾。轉(zhuǎn)染后將106個LNCaP細胞用100μL的PBS溶液重懸，注入裸鼠皮下。經(jīng)過6周的生長，測定實驗組和對照組腫瘤的重量、大小以及腫瘤中雄激素受體的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過miR-185m轉(zhuǎn)染后，LNCaP細胞的致瘤作用顯著減弱，主要表現(xiàn)為腫瘤的大小和重量較對照組顯著降低，另外western-bl

14、otting證實腫瘤中AR的表達也顯著降低。8周后解剖發(fā)現(xiàn)，裸鼠肝臟出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，比較發(fā)現(xiàn)，高表達miR-185的LNCaP細胞所形成的轉(zhuǎn)移性肝結(jié)節(jié)顯著少于對照組。上述研究證實miR-185在裸鼠體內(nèi)同樣具有腫瘤抑制作用。
　　 綜合本實驗研究結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：miR-185可以作為“tumorsuppressor”抑制前列腺細胞的腫瘤生物學(xué)特性，此作用的發(fā)揮依靠miR-185直接作用于雄激素受體。由miR-185過表