簡(jiǎn)介：研究背景及目的肝纖維化是慢性肝損傷進(jìn)展至肝硬化的重要階段，以細(xì)胞外基質(zhì)EXTRACELLULARMATRIX，ECM過度沉積為主要病理特征。盡管肝臟中許多類型的細(xì)胞如肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等都參與了肝纖維化過程，但肝星狀細(xì)胞HEPATICSTELLATECELLS，HSCS是產(chǎn)生ECM的最主要細(xì)胞。當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí)，HSC活化并分化為成纖維樣細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)Α平滑肌肌動(dòng)蛋白ΑSMOOTHMUSCLEACTIN，ΑSMA、分泌促纖維生成ECM。因此，控制HSC的活性可為肝纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。微小RNAMICRNA，MIRNA是一類約有2125個(gè)堿基的非編碼小RNA，它通過完全或不完全結(jié)合于靶序列的3’UTR端，降解靶基因MRNA或抑制其翻譯，對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。近年來，大量研究表明MIR21參與介導(dǎo)了多種器官纖維化的發(fā)生，如肺，肝臟，心臟等。我們的前期初步研究發(fā)現(xiàn)，MIR21是與HSC活化相關(guān)的MIRNA，對(duì)于肝纖維化發(fā)病機(jī)制研究和臨床治療具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文旨在探討MIR21對(duì)HSC活化和生物學(xué)活性的調(diào)控作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法一、檢測(cè)不同活化狀態(tài)大鼠HSC和HSCT6MIR21及相關(guān)基因差異表達(dá)膠原酶改良原位循環(huán)灌流法分離雄性SPRAGUEDAWLEYSD大鼠原代HSC，分設(shè)三組靜息狀態(tài)組即原代培養(yǎng)2天；TGFΒ2NGML刺激3天組；TGFΒ刺激7天組。REALTIMERTPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞MIR21及纖維化相關(guān)基因組織金屬蛋白酶抑制1TISSUEINHIBITOFMETALLOPROTEINASE1，TIMP1、基質(zhì)金屬蛋白酶類MATRIXMETALLOPROTEINASES，MMPS、ΑSMA及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶EXTRACELLULARSIGNALREGULATEDKINASE，ERK、SPRY2的表達(dá)。二、檢測(cè)正常大鼠及肝纖維化模型肝臟組織及血清MIR21差異表達(dá)將雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組7只。第1組為正常對(duì)照組，第2～4組為實(shí)驗(yàn)組，分別為二甲基亞硝胺DMN注射1周組、2周組和4周組。2～4組予1％DMN100UL100G體重腹腔注射，每周連續(xù)注射3次，分別于注射1周、2周、4周處死大鼠，留取大鼠靜脈血及肝臟組織；HE、MASSON、VG染色檢測(cè)ECM含量并對(duì)肝纖維化程度分級(jí)，圖像分析儀半定量分析；REALTIMERTPCR檢測(cè)肝臟組織及血清中MIR21的表達(dá)；REALTIMERTPCR測(cè)定肝組織TIMP1、MMPS、ΑSMA、ERK、SPRY2的表達(dá)。三、下調(diào)MIR21表達(dá)對(duì)HSCT6細(xì)胞生物學(xué)特性的影響用LIPOFECTAMINE2000將MIR21INHIBIT轉(zhuǎn)染HSCT6細(xì)胞，6小時(shí)換液，48小時(shí)后TRIZOL法抽提MIRNA，REALTIMERTPCR鑒定MIR21表達(dá)；CCK8檢測(cè)HSCT6細(xì)胞的增殖情況；REALTIMERTPCR肝纖維化相關(guān)基因ΑSMA、TIMP1及MMPS等MRNA和蛋白表達(dá)變化；四、下調(diào)MIR21表達(dá)對(duì)HSCT6ERK信號(hào)通路的調(diào)控作用用LIPOFECTAMINE2000將MIR21INHIBIT轉(zhuǎn)染HSCT6細(xì)胞，6小時(shí)換液，48小時(shí)后抽提蛋白和總RNA，WESTERNBLOT法檢測(cè)MIR21調(diào)控靶蛋白SPRY2表達(dá)；REALTIMERTPCR和WESTERNBLOT法檢測(cè)ERK通路相關(guān)基因PERK12、ERK12、RSK2的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)ERK通路相關(guān)基因ERK1、RSK2、SPRY2的表達(dá)。五、驗(yàn)證MIR21對(duì)SPRY23UTR的靶向調(diào)控作用設(shè)計(jì)SPRY23UTR報(bào)告基因質(zhì)粒，同時(shí)合成MIR21寡核苷酸片段MIR21MIMIC，將MIR21MIMIC與SPRY2報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，證實(shí)SPRY2為MIR21的靶基因。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS110統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以X±S表示。P實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、MIR21表達(dá)隨HSC活化逐步上調(diào)REALTIMERTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著原代HSC的不斷活化，MIR21表達(dá)逐步上調(diào)P二、MIR21在DMN大鼠肝纖維化模型肝組織和血清中含量升高REALTIMERTPCR法檢測(cè)表明，肝纖維化組與正常組相比，肝組織和血清中MIR21表達(dá)明顯上調(diào)P三、下調(diào)MIR21表達(dá)可降低HSCT6細(xì)胞生物學(xué)活性MIR21INHIBIT轉(zhuǎn)染HSCT6后，REALTIMERTPCR法檢測(cè)MIR21表達(dá)下調(diào)約80％P四、下調(diào)MIR－21表達(dá)可降低HSC－T6ERK通路活性MIR－21INHIBIT轉(zhuǎn)染HSC－T6后，ERK1、RSK2MRNA水平表達(dá)分別下調(diào)35％和36％P五、報(bào)告基因測(cè)定證實(shí)上調(diào)MIR21表達(dá)可降低SPRY2熒光素酶活性MIR－21MIMIC與SPRY23’UTR報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK－293細(xì)胞，結(jié)果顯示MIR21表達(dá)上調(diào)后，SPRY2報(bào)告基因質(zhì)粒熒光素酶活性降低。結(jié)論一、MIR－21在活化HSC、肝纖維化模型肝組織、血清中表達(dá)上調(diào)。二、體外下調(diào)MIR－21表達(dá)可降低HSC－T6細(xì)胞的生物學(xué)活性。三、體外下調(diào)MIR－21表達(dá)可降低ERK通路活性，SPRY2為其調(diào)控的直接靶點(diǎn)。

簡(jiǎn)介：幽門螺桿菌PPIASE穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究STUDYONBIOLOGICALEFFECTANDPROTEOMICSOFH彤LORIPPIASESTABLECELLLINE導(dǎo)論文課題起止時(shí)間至QQ皇生皇月二至Q至生旦論文完成時(shí)間至Q羔至生壘月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧2012年4月目錄一、摘要中文論著摘要I英文論著摘要5二、英文縮略語9三、論文論文一幽門螺旋桿菌PPIASE真核重組表達(dá)載體及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建前言10日U舌一”一一””一”””””“””“一”“””””“””“””一”10材料與方法LL實(shí)驗(yàn)結(jié)果21討論26結(jié)侖27參考文獻(xiàn)28論文二幽門螺桿菌PPIASE穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)研究前言30日U舌“一一“一””一“”““““““”“””““”””一””“30材料與方法3L實(shí)驗(yàn)結(jié)果36討論40結(jié)論4L參考文獻(xiàn)42論文三幽門螺桿菌PPIASE穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究前言45日U舌““”””“”“”“““”””””””“”””“”””“”45材料與方法45實(shí)驗(yàn)結(jié)果5L討論59結(jié)論61參考文獻(xiàn)62四、本研究創(chuàng)新性自我評(píng)價(jià)65五、附錄

簡(jiǎn)介：目的研究不同濃度的甲基強(qiáng)的松龍（甲強(qiáng)龍）對(duì)BMSCS增殖、凋亡和成骨分化的影響，探討其可能的機(jī)制。方法從4周齡雌性SD大鼠中獲取骨髓細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并通過表面抗原和多能分化能力鑒定其為BMSCS。含不同濃度（105108MOLL）甲強(qiáng)龍的培養(yǎng)液作用于BMSCS，通過MTS法檢測(cè)甲強(qiáng)龍對(duì)BMSCS增殖的影響，通過ANNEXINVPI雙染色法檢測(cè)甲強(qiáng)龍對(duì)BMSCS凋亡的影響。不同濃度的甲強(qiáng)龍（105108MOLL）加維生素C和甘油誘導(dǎo)BMSCS成骨分化，21天后進(jìn)行茜素紅染色，并采用RTPCR法檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、OPN、OCN和BMP2的表達(dá)情況。結(jié)果原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，CD29和CD90陽性，CD45和CD34陰性，而且這些細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化的多向分化能力，表明提取的細(xì)胞屬于BMSCS。研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度的甲強(qiáng)龍≥106MOLL組中細(xì)胞相對(duì)增值率ODMTS較對(duì)照組明顯下降，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率IR明顯升高，BMSCS細(xì)胞裂解壞死增加，數(shù)量減少，凋亡率明顯升高，而低濃度的甲強(qiáng)龍≤107MOLL的ODMTS、IR和凋亡率與對(duì)照組差異不大。106MOLL、107MOLL甲強(qiáng)龍組茜素紅染色陽性，ALP、OPN、OCN和BMP2表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，而105MOLL和108MOLL甲強(qiáng)龍組茜素紅染色陰性，ALP、OPN、OCN和BMP2表達(dá)量保持在較低水平。單獨(dú)抗壞血酸和Β甘油磷酸誘導(dǎo)組茜素紅染色陰性，ALP、OPN、OCN和BMP2表達(dá)量與對(duì)照組比較沒有明顯差異。結(jié)論研究表明1高濃度甲強(qiáng)龍≥106MOLL能夠明顯抑制BMSCS增殖，并且顯著促進(jìn)BMSCS凋亡，而低濃度組作用變化沒有顯著差異，提示甲強(qiáng)龍對(duì)BMSCS增殖和凋亡的影響具有濃度依賴性。2只有在濃度適當(dāng)?shù)臈l件下，甲強(qiáng)龍可以誘導(dǎo)BMSCS成骨分化，而濃度過高或過低均不利于誘導(dǎo)成功。綜合既往研究成果，發(fā)現(xiàn)甲強(qiáng)龍不僅在成骨細(xì)胞階段影響骨形成，而且早在BMSCS階段就已經(jīng)發(fā)揮其影響，這提示甲強(qiáng)龍?jiān)贐MSCS到成骨細(xì)胞這條通路上都有作用。

簡(jiǎn)介：壁盟曼魚殖坌腸癌勝疸緝胞生塹堂⑧．論文作者簽名軀魚董指導(dǎo)教師簽名互隧論文評(píng)閱人L評(píng)閱人2評(píng)闋人3評(píng)閱人4評(píng)閱人5答辯委員會(huì)主席委員L委員2委員3委員4委員5浙江大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得藍(lán)婆太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料．與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意．學(xué)位論文作者簽名私海游簽字日期訓(xùn)肛年虧月’7日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解．浙婆太堂．有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交本論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閿和借閱。本人授權(quán)溢塑盔堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文．保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書學(xué)位論文作者簽名訝父J勾諸簽字目期伽I≯年鄉(xiāng)月2C7日導(dǎo)師簽名簽字目期∥緝廠月多甲日

簡(jiǎn)介：第四軍醫(yī)大學(xué)第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文NOK與EGFR在NSCLC表達(dá)相關(guān)性及高表達(dá)表達(dá)相關(guān)性及高表達(dá)NOK細(xì)胞系細(xì)胞系SPCA1NOK生物學(xué)特性研究生物學(xué)特性研究專業(yè)名稱專業(yè)名稱外科學(xué)外科學(xué)作者姓名作者姓名劉濤劉濤指導(dǎo)老師指導(dǎo)老師李小飛李小飛碩士學(xué)位論文目錄縮略語表縮略語表1中文摘要中文摘要2英文摘要英文摘要5前言9文獻(xiàn)回顧文獻(xiàn)回顧10正文19實(shí)驗(yàn)一NOK與EGFR在肺癌組織中相關(guān)性研究191材料和試劑192方法213結(jié)果244討論27實(shí)驗(yàn)二NOK高表達(dá)肺腺癌細(xì)胞系的篩選及建立291材料和試劑292方法303結(jié)果354討論40實(shí)驗(yàn)三SPCA1NOK細(xì)胞系的NOK表達(dá)鑒定421材料和試劑422方法433結(jié)果464討論52

簡(jiǎn)介：第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F對(duì)OP18基因表達(dá)及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為作用研究姓名林芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)病理與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師張惠中20070501獨(dú)獨(dú)創(chuàng)創(chuàng)性性聲聲明明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)風(fēng)與優(yōu)良的科學(xué)道德，本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，不包含本人或他人已申請(qǐng)學(xué)位或其他用途使用過的成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了致謝。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名林芳日期20070606保保護(hù)護(hù)知知識(shí)識(shí)產(chǎn)產(chǎn)權(quán)權(quán)聲聲明明本人完全了解第四軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬第四軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位仍然為第四軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容（含電子版，保密內(nèi)容除外），可以采用影印，縮印或其他復(fù)制手段保存論文。學(xué)校有權(quán)允許論文被查閱和借閱，并在校園網(wǎng)上提供論文內(nèi)容的瀏覽和下載服務(wù)。論文作者簽名林芳導(dǎo)師簽名張惠中日期20070606

簡(jiǎn)介：遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文硒、鉬、硼對(duì)氟中毒大鼠氟代謝及其成釉細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究姓名湯曄申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師陳黎明20100501遵義醫(yī)學(xué)院碩一LJ學(xué)位論文硒、鉬、硼對(duì)氟中鴦本鼠氟代謝及JE成釉細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)生過程中成釉細(xì)胞中調(diào)控基因增殖細(xì)胞核抗原PROLIFERATINGCELLNUCLEARANTIGEN，PCNA、原癌基因CMYC的表達(dá)。采用圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。結(jié)果L、隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，各組體重逐漸增加，硒組高于鉬組和硼組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005。尿氟濃度升高。16周末，氟組尿氟濃度降低，與硒組、鉬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PO05。2、氟牙癥情況各組在四周末均出現(xiàn)氟牙癥，隨染氟時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)中度氟牙癥，未出現(xiàn)重度氟牙癥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，硒組有三例無氟牙癥，與硼組、鉬組、氟組比較有意義P005。鉬組及硼組氟牙癥癥狀輕于氟組。3、尿羥脯氨酸情況16周時(shí)，硒組含量低于氟組、鉬組、硼組，比較有差異P005。4、HE染色結(jié)果對(duì)照組大鼠成釉細(xì)胞成高柱狀，排列均勻一致。氟組成釉細(xì)胞排列極不規(guī)則，大量細(xì)胞扭曲，釉質(zhì)變薄。硒、鉬、硼組介于兩者之間。5、TEM結(jié)果實(shí)驗(yàn)組成釉細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞器的減少，細(xì)胞膜、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜受到不同程度的損傷。6、細(xì)胞凋亡、PCNA、CMYC表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡抑制，CMYC的表達(dá)減弱，PCNA表達(dá)增強(qiáng)，以硒組明顯。結(jié)論L、在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量下，硒、鉬、硼可能具有拮抗氟中毒的作用，從大鼠的體重增長(zhǎng)、氟斑牙形成情況表明硒的作用可能優(yōu)于鉬、硼2、本實(shí)驗(yàn)后期出現(xiàn)尿羥脯氨酸增加，與以往研究結(jié)果一致。3光、電鏡結(jié)果顯示氟中毒可以導(dǎo)致成釉細(xì)胞損傷。硒、鉬、硼具有拈抗氟引起的細(xì)胞損傷作用。4、硒、鉬、硼減輕氟毒性可能通過拮抗氟引起的細(xì)胞凋亡、CMYC表達(dá)增強(qiáng)、PCNA表達(dá)減弱等作用有關(guān)關(guān)鍵詞氟中毒；硒；鉬；硼拮抗；PCNA；CMYC；基金項(xiàng)目貴陽市社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃2009筑科農(nóng)合同制第3039號(hào)3

簡(jiǎn)介：分類號(hào)密級(jí)國(guó)際十進(jìn)分類號(hào)（UDC）第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文誘導(dǎo)MSP58基因高表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響（題名和副題名）王江（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名章翔教授（主任醫(yī)師）指導(dǎo)教師單位第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別醫(yī)學(xué)碩士專業(yè)名稱外科學(xué)（神外）論文提交日期200904答辯日期200905論文起止時(shí)間2007年11月至2009年4月學(xué)位授予單位第四軍醫(yī)大學(xué)誘導(dǎo)誘導(dǎo)MSP58基因高表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤基因高表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響研究生王江學(xué)科專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科學(xué)）所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科導(dǎo)師章翔教授（主任醫(yī)師）輔導(dǎo)教師林偉博士張璟博士資助基金項(xiàng)目資助基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金（39970752）關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞MSP58；基因；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；增殖；侵襲中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)2009年5月

簡(jiǎn)介：由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學(xué)難題。對(duì)于從根本上提高其治療效果而言，明確骨形成、重建、塑形的病理生理學(xué)特點(diǎn)及其生物學(xué)機(jī)制是其基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。骨組織是一種伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)礦化、根據(jù)需要不斷自我修復(fù)的復(fù)雜動(dòng)態(tài)組織，亦是帶有血管、神經(jīng)支配的生物活性組織，因此，骨折修復(fù)過程中既有機(jī)體多種組織、細(xì)胞因子之間錯(cuò)綜復(fù)雜的協(xié)同作用，更與血液供應(yīng)、神經(jīng)支配密切相關(guān)，其修復(fù)區(qū)域內(nèi)環(huán)境的生物學(xué)穩(wěn)定性尤其是血液供應(yīng)和神經(jīng)支配的重建是關(guān)鍵因素。血液供應(yīng)的重建對(duì)于骨及移植物保持生物學(xué)活性的重要性已被眾多實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐所證實(shí)，除此之外，骨組織再生中神經(jīng)因素可能同樣發(fā)揮著重要作用。骨骼系統(tǒng)是充滿活力和不斷重建的組織，由大量感覺神經(jīng)元支配著。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，降鈣素基因相關(guān)肽CALCITONINGENERELATEDPEPTIDE，CGRP是主要的神經(jīng)遞質(zhì)。大量文獻(xiàn)證實(shí)CGRP具有促進(jìn)骨代謝作用。在骨骼發(fā)育過程中，降鈣素基因相關(guān)肽免疫陽性CGRPIMMUNEACTIVE，CGRPIR周圍神經(jīng)在骨形成區(qū)域非常豐富與此一致的是，骨折愈合時(shí)，可以看到神經(jīng)纖維的生成。在成角骨折的模型中，LIETAL發(fā)現(xiàn)在新骨生成特別多的區(qū)域，新形成的神經(jīng)纖維也特別豐富，其血液中CGRP濃度也增高。CGRPIR周圍神經(jīng)在骨代謝活性的部位如干骺端、骨膜、骨軟骨結(jié)合處的生長(zhǎng)板分布較為密集。骨組織的CGRPIR神經(jīng)纖維的數(shù)量在骨發(fā)育和修復(fù)過程中增加，提示它們直接參與局部骨重建的調(diào)節(jié)。CGRP基因敲除的小鼠表現(xiàn)為骨形成速率下降和骨丟失加速，化學(xué)和外科方法切除周圍神經(jīng)導(dǎo)致負(fù)重骨和非負(fù)重骨機(jī)械負(fù)荷能力下降。而在骨不連時(shí)，骨折殘段CGRPIR神經(jīng)纖維明顯缺失。當(dāng)用辣椒素去除大鼠的無髓鞘感覺神經(jīng)元的CGRP時(shí)，伴隨著骨丟失和骨脆性增加。類似地，有著家族性植物神經(jīng)失調(diào)綜合征的病人，常導(dǎo)致無髓鞘神經(jīng)元的破壞伴隨著神經(jīng)肽信號(hào)的減少，骨礦密度下降和骨脆性的增加。同時(shí)骨組織也是高度血管化的組織，血管形成是骨生成和發(fā)育過程中的關(guān)鍵步驟。骨骼發(fā)生及形成通過兩條不同途徑膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。雖然是兩種不同的成骨方式，它們有著共同的特征形成血管是它們發(fā)生的先決條件。同時(shí)有活性的微脈管系統(tǒng)的形成和發(fā)育是骨重建和骨折愈合的必需過程，血管生成在骨折后骨再生的整個(gè)過程中起著主要作用，血管生成能恢復(fù)骨折部位的血流，能通過產(chǎn)生生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性，募集干細(xì)胞和定向分化分成骨細(xì)胞以促進(jìn)骨形成。因此顯而易見的是，血管作為營(yíng)養(yǎng)成分的主要供給者在骨的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。但是，血管不只是單單提供營(yíng)養(yǎng)，有研究表明成骨祖細(xì)胞停留在人骨髓血管壁上，而當(dāng)骨折伴隨著嚴(yán)重的血管損傷，導(dǎo)致局部缺血時(shí)，會(huì)導(dǎo)致延遲愈合或不愈合。在行骨牽引時(shí)，急性牽引（產(chǎn)生過大的機(jī)械負(fù)荷）能中斷血管生成過程，阻止骨生成和導(dǎo)致纖維性不愈合。TNP470抑制新血管的形成能阻止大鼠的骨折愈合，相反，外源性添加外來的促血管生成因子時(shí)，能顯著加速骨折愈合。而在骨組織中絕大多數(shù)CGRPIR神經(jīng)纖維與血管伴行。我們實(shí)驗(yàn)室在前期研究發(fā)現(xiàn)植入周圍神經(jīng)能促進(jìn)組織工程骨成骨及修復(fù)骨缺損，骨缺損部位的神經(jīng)肽明顯增加，且感覺神經(jīng)束植入的組織工程骨內(nèi)可見較多血管。由于CGRPIR周圍神經(jīng)和血管生成在骨發(fā)育和修復(fù)中都具有不可或缺的作用。因此，周圍神經(jīng)和血管在骨修復(fù)及重建中有著什么樣的關(guān)系周圍神經(jīng)是否可通過促進(jìn)骨組織的血管生成進(jìn)一步促進(jìn)骨修復(fù)和重建本實(shí)驗(yàn)研究的是周圍神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽CGRP對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制研究，以進(jìn)一步明確周圍神經(jīng)在骨組織中的作用。研究目的神經(jīng)肽CGRP受體在HUVECS上的表達(dá)特點(diǎn)明確神經(jīng)肽CGRP調(diào)控HUVECS增殖和遷移的作用及其機(jī)制。初步探明神經(jīng)肽CGRP在HUVECS血管生成中的生物效應(yīng)及機(jī)制。比較CGRP與VEGF體外促HUVECS增殖、遷移、成管的作用大小第1部分人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取、鑒定以及其表面CGRP受體的表達(dá)目的獲取用于作為種子細(xì)胞的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，并對(duì)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)記蛋白以及細(xì)胞上CGRP受體進(jìn)行鑒定方法1人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取、鑒定用胰酶消化新生兒剖宮產(chǎn)臍帶，用含20％FBS的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基EMG2在37°5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)消化下來的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞行形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察以及采用細(xì)胞免疫熒光對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。2臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞上CGRP受體的檢測(cè)HUVECS在蓋玻片上生長(zhǎng)融合為單層后，以4％多聚甲醛固定30MIN，正常山羊血清封閉30MIN，分空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加CGRP1受體，空白對(duì)照組不加CGRP1受體，置于濕盒中4℃過夜，加入DYLIGHT594標(biāo)記的山羊抗兔IGG，置于37℃中30MIN，以5ΜGMLDAPI染核10MIN，緩沖甘油封片，于倒置熒光相差顯微鏡下觀察。結(jié)果成功分離培養(yǎng)出臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)鑒定符合血管內(nèi)皮細(xì)胞特征，CGRP受體存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞上。結(jié)論胰酶消化培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞為臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞存在有CGRP受體。實(shí)驗(yàn)證實(shí)CGRP受體存在于臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECS上，從而為進(jìn)一步研究CGRP對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用提供理論依據(jù)。第2部分降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制研究目的探討降鈣素基因相關(guān)肽（CALCITONINGENERELATEDPEPTIDE，CGRP）對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUMANUMBILICALVEINENDOTHELIALCELLS，HUVECS增殖與遷移的作用，進(jìn)一步揭示組織工程骨的神經(jīng)化促血管生成機(jī)制。方法取第1代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組分為6組，分別以0A組、11012（B組）、11011（C組）、11010（D組）、1109（E組）、1108MOLL組（F組）濃度CGRP干預(yù)HUVECS。采ALARMARBLUE法動(dòng)態(tài)檢測(cè)各組HUVECS增殖率，TRANSWELL小室檢測(cè)各組HUVECS的遷移能力，ELISA法檢測(cè)HUVECS分泌VEGF的水平，QPCR以及WESTERNBLOT法監(jiān)測(cè)其局部粘著斑激酶（FOCALADHESIONKINASE，F(xiàn)AK）的表達(dá)。結(jié)果CGRP呈時(shí)間濃度依賴性刺激HUVECS增殖。不同濃度組之間細(xì)胞增殖率有顯著性差異F129680，P0000，在6個(gè)組均如此，F(xiàn)值分別為388492，252495，350317，232151，81929，661715，均為P＜0001從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的細(xì)胞增殖率均有顯著性差異F10665，P0000，在五個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為14289，31818，24789，33855，18762，均為P＜0001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存在著交互效應(yīng)F37777，P0000B～F組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率均高于A組P＜0001，F(xiàn)組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率最高。B～F組遷移細(xì)胞數(shù)均顯著高于A組F73232，P＜0001，最大增幅達(dá)3倍以上。B～F組VEGF分泌量均顯著高于A組F20853，P＜0001C，D組促進(jìn)細(xì)胞分泌VEGF的能力最強(qiáng)。QPCR與WESTERNBLOT檢測(cè)示，與A組相比，B～F組CGRP刺激HUVECS3、7、10D后，F(xiàn)AK表達(dá)明顯增加。不同濃度組之間FAK的表達(dá)有顯著性差異F3012，P0000，在6個(gè)組均如此，F(xiàn)值分別為6860，34458，145882，18335674706313，均為P＜0001從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的FAK的表達(dá)均有顯著性差異F2001，P0000，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為2194163716，77441，均為P＜0001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存在著交互效應(yīng)45010，P0000結(jié)論CGRP對(duì)HUVECS的增殖和遷移有直接促進(jìn)作用，CGRP促進(jìn)VEGF分泌和增加FAK的表達(dá)與此密切相關(guān)。第3部分CGRP促HUVECS體外血管生成的作用及其生物學(xué)機(jī)制目的觀察降鈣素基因相關(guān)肽CALCITONINGENERELATEDPEPTIDE，CGRP對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUMANUMBILICALVEINENDOTHELIALCELLS，HUVECS成血管作用，并探討其生物學(xué)機(jī)制。方法體外分離獲取HUVECS，采用體外成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CGRP的血管生成作用，采用ELISA法檢測(cè)CGRP直接間接作用于HUVECS時(shí)，VEGF的分泌水平。QPCR檢測(cè)CGRP刺激細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)，VEGF、VEGF受體1FLT1、VEGF受體2KDR及CGRP受體1的MRNA表達(dá)，WESTERNBLOT檢測(cè)HUVECS的FLT1、KDR的蛋白表達(dá)。結(jié)果體外成管實(shí)驗(yàn)顯示CGRP有明顯的促血管生成作用F53161，P0000。ELISA顯示CGRP能促進(jìn)HUVEC分泌VEGF。QPCR示CGRP促VEGFMRNA表達(dá)升高，不同濃度組之間VEGFMRNA的表達(dá)有顯著性差異F18097，P0000，在6個(gè)組均如此，F(xiàn)值分別為60813，19137，22690，35998，42529，45619，均為P＜0001從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的VEGFMRNA均有顯著性差異F1324，P0000，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為2416，3703，9442，均為P＜0001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存在著交互效應(yīng)423457，P0000。CGRP同樣能促進(jìn)CGRPRMRNA的表達(dá)的增加，不同濃度組之間CGRPRMRNA的表達(dá)有顯著性差異F5430，P0000，在6個(gè)組均如此，F(xiàn)值分別為31609，22184，79228，14390，8806，7235，均為P＜0001從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的CGRPRMRNA的表達(dá)均有顯著性差異F2493，P0000，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為5233，29948，10641，均為P＜0001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存在著交互效應(yīng)F4787，P0000。且在第10天時(shí)最為明顯。而1012～108MCGRP組的FLT1MRNA與KDRMRNA表達(dá)在3D、7D、10D時(shí)均比對(duì)照組高P＜0001。WESTERNBLOT結(jié)果顯示1012～108MCGRP組能顯著促進(jìn)HUVECS表達(dá)FLT1，KDR。結(jié)論CGRP能明顯促進(jìn)HUVECS的體外生成血管，可能與其促進(jìn)VEGF分泌，增強(qiáng)HUVECS的FLT1與KDR表達(dá)有關(guān)且同時(shí)，CGRP的受體表達(dá)也增加，可進(jìn)一步增強(qiáng)CGRP的促血管生成作用。第4部分CGRP與VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管作用的比較目的比較降鈣素基因相關(guān)肽CALCITONINGENERELATEDPEPTIDE，CGRP與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VULARENDOTHELIALGROWTHFACT，VEGF）對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞殖、遷移、體外成管的作用。方法實(shí)驗(yàn)分9組，1012108MCGRP，520NGMLVEGF165，另設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。采用細(xì)胞免疫熒光觀察HUVECS的CGRP受體CALCITONINGENERELATEDPEPTIDERECEPTS，CGRPR表達(dá)情況，ALARMARBLUE法動(dòng)態(tài)檢測(cè)各組HUVECS的增殖率，TRANSWELL小室檢測(cè)各組HUVECS的遷移能力。采用體外成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組促血管生成作用大小。QPCR檢測(cè)CGRP和VEGF165刺激細(xì)胞時(shí)，CGRP受體的MRNA表達(dá)情況。結(jié)果CGRP及VEGF165時(shí)間濃度依賴性促進(jìn)HUVECS增殖，VEGF165促內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力強(qiáng)于CGRP，差異有顯著性F6339，P0000。CGRP及VEGF165都能明顯促進(jìn)HUVECS遷移F609，P0000及促進(jìn)HUVECS在基質(zhì)膠中形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)F3488，P0000。CGRP與VEGF促細(xì)胞遷移P0124及促成管P0449的最大作用無顯著性差異。CGRP與VEGF165都能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中CGRP受體表達(dá)水平增加F52038，P0000，但是CGRP促CGRP受體生成作用明顯強(qiáng)于VEGF165P＜0001。結(jié)論CGRP是強(qiáng)的促血管生成因子，其促血管生成的作用與低濃度（520NGML）VEGF165相當(dāng)。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性和體外誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞治療神經(jīng)性勃起功能障礙的初步研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文SDF1CXCR4軸對(duì)人牙髓細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究姓名龔啟梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師凌均棨20080510碩士學(xué)位論文SDF1CXCR4軸對(duì)人牙髓細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究方法①采用酶消化組織塊法進(jìn)行HDPCS的原代培養(yǎng)免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定；取第3～5代HDPCS，MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HDPCS上CXCIⅥ的表達(dá)情況。②用不同濃度LPS01、L、LO、100“∥M1和TNFQ1、10、100N∥M1刺激HDPCS48H后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SDFL含量的變化。③用含有不同濃度RHSDF15、50、100、200N∥M1的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HDPCS48H和72H后，M1VR法觀察細(xì)胞增殖的情況；同時(shí)，ARULEXINV／PI法觀察100N∥MLRHSDF1作用HDPCS48H時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。④體外趨化實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度RHSDF110、30、50、100N咖1對(duì)HDPCS遷移的影響。⑤用不同濃度RHSDF11、10、30、50、100NG／M1的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)HDPCS15D后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP活性的變化。結(jié)果①酶消化組織塊法可有效進(jìn)行HDPCS的原代培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示所獲得的細(xì)胞均為抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性。MTT結(jié)果顯示細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖活性。免疫熒光顯示HDPCS胞膜表達(dá)CXCIH。②ELISA結(jié)果顯示未受刺激的對(duì)照組HDPCS分泌SDFL，濃度約為451355L962918P∥ML。不同濃度LPS和N師Q刺激HDPCS48H后，除100NG／MLTNF0【組外P005，其余各實(shí)驗(yàn)組的SDF1表達(dá)量均較對(duì)照組顯著降低尸O05。ANNEXINV／PI結(jié)果提示LOONG／MLRHSDF1對(duì)HDPCS的凋亡無明顯影響￡0272，尸O602。④體外趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除30NG／MLRHSDF1組外戶|O05，50N∥ML和100N∥ML兩濃度組與對(duì)照組問均有顯著差異尸001，且隨著RHSDFL濃度的升高其趨化作用逐漸增強(qiáng)。相關(guān)分析表明，RHSDF1濃度與其趨化的細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，S0634，尸001。⑤不同濃度RHSDFL作用于HDPCS15D后，除LN∥ML和10NG／ML兩濃度組外，其余各實(shí)驗(yàn)組ALP活性均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P001。ALP活性在50N∥ML時(shí)達(dá)到最大值，超過此濃度時(shí)，其刺激作用不再隨濃度的升高而增強(qiáng)。結(jié)論HDPCS表達(dá)CXCR4并分泌SDF1，LPS和TNF噸可抑制HDPCS分泌SDF1。

簡(jiǎn)介：廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表的研究成果，均在文中以適當(dāng)方式明確標(biāo)明，并符合法律規(guī)范和廈門大學(xué)研究生學(xué)術(shù)活動(dòng)規(guī)范試行。另外，該學(xué)位論文為課題組的研究成果，獲得課題組經(jīng)費(fèi)或?qū)嶒?yàn)室的資助，在實(shí)驗(yàn)室完成。請(qǐng)?jiān)谝陨侠ㄌ?hào)內(nèi)填寫課題或課題組負(fù)責(zé)人或?qū)嶒?yàn)室名稱，未有此項(xiàng)聲明內(nèi)容的，可以不作特別聲明。聲明人簽名毫黲翠汽為I二年∥月／日廈門大學(xué)學(xué)位論文著作權(quán)使用聲明本人同意廈門大學(xué)根據(jù)中華人民共和國(guó)學(xué)位條例暫行實(shí)施辦法等規(guī)定保留和使用此學(xué)位論文，并向主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文包括紙質(zhì)版和電子版，允許學(xué)位論文進(jìn)入廈門大學(xué)圖書館及其數(shù)據(jù)庫被查閱、借閱。本人同意廈門大學(xué)將學(xué)位論文加入全國(guó)博士、碩士學(xué)位論文共建單位數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版，采用影印、縮印或者其它方式合理復(fù)制學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于1．經(jīng)廈門大學(xué)保密委員會(huì)審查核定的保密學(xué)位論文，于年月日解密，解密后適用上述授權(quán)。V2．不保密，適用上述授權(quán)。請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)括號(hào)內(nèi)打“√“或填上相應(yīng)內(nèi)容。保密學(xué)位論文應(yīng)是已經(jīng)廈門大學(xué)保密委員會(huì)審定過的學(xué)位論文，未經(jīng)廈門大學(xué)保密委員會(huì)審定的學(xué)位論文均為公開學(xué)位論文。此聲明欄不填寫的，默認(rèn)為公開學(xué)位論文，均適用上述授權(quán)。聲明人簽名加化年么月

簡(jiǎn)介：1995年P(guān)BFISHER用差減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的與人黑色素瘤分化相關(guān)基因，當(dāng)時(shí)稱為MDA7（MELANOMADIFFERENTIATIONASSOCIATEDGENE7），并發(fā)現(xiàn)隨著黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，MDA7的表達(dá)逐漸減少至最終消失，證實(shí)了其表達(dá)產(chǎn)物MDA7具有抑制黑色素瘤細(xì)胞增生、促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞終末分化的能力。隨后，MDA7一直作為腫瘤抑制物被研究。直到2002年，CAUDELL等研究證實(shí)了MDA7的細(xì)胞因子屬性，重新命名為人白細(xì)胞介素24（HUMANINTERLEUKIN24，HIL24）。迄今為止，已有大量實(shí)驗(yàn)證明HIL24具有顯著的選擇性抑制多種腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，這種抑制作用不依賴P53、RB和P16等抑癌基因的狀態(tài)，且對(duì)正常細(xì)胞沒有影響。HIL24作為細(xì)胞因子，不僅在激活免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)整個(gè)抗癌免疫反應(yīng)和造血系統(tǒng)中起重要作用，還具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移作用，其顯著的抗腫瘤特性使之成為腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)。2004年，INTROGEN公司研制的基因治療制劑ADIL24，即重組復(fù)制缺陷型腺病毒IL24，商品名為INGN241，獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，體內(nèi)外試驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了HIL24顯著的抗腫瘤效果。隨著對(duì)HIL24作用機(jī)制和基因治療方面深入的研究，一方面肯定了HIL24生物學(xué)功能和治療效果，另一方面表現(xiàn)出對(duì)HIL24的大量需求，所以，通過基因工程手段大規(guī)模生產(chǎn)高純度有活性的重組HIL24成為必然。本研究分別采用大腸桿菌（原核）表達(dá)系統(tǒng)制備了融合蛋白TRXIL24，并用腸激酶酶切TRXIL24得到重組蛋白IL24，以及采用畢赤酵母（真核）表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)了重組糖蛋白R(shí)IL24，分析鑒定了三種重組蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性，為深入研究其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制和腫瘤治療應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究目的構(gòu)建HIL24的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，獲得三種重組蛋白TRXIL24、IL24和RIL24。建立TRXIL24和IL24的制備、純化及復(fù)性的中試生產(chǎn)工藝。篩選高效分泌表達(dá)RIL24的重組畢赤酵母工程菌。鑒定三種重組蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。研究方法1）人白細(xì)胞介素24基因的克隆采用RTPCR和NESTEDPCR方法，從CONA刺激培養(yǎng)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞中，克隆帶信號(hào)肽的HIL24編碼序列（HMIL24）和不帶信號(hào)肽的HIL24編碼序列（HIL24）。2）人白細(xì)胞介素24基因在大腸桿菌中的表達(dá)與純化為避免引入多余的氨基酸，利用載體PET32A上的腸激酶識(shí)別位點(diǎn)編碼堿基之前的KPNⅠ位點(diǎn)，及多克隆位點(diǎn)BAMHⅠ，將HIL24插入到PET32A中，構(gòu)建重組基因工程菌PET32AHIL24ECOLIBL21DE3，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白TRXIL24。TRXIL24包涵體經(jīng)洗滌、溶解后，采用鎳離子親合柱層析和凝膠分子篩柱層析相結(jié)合的二步法純化制備高純度的融合蛋白。用腸激酶酶切融合蛋白TRXIL24得到TRX和IL24兩個(gè)多肽段，利用兩個(gè)多肽段純化標(biāo)簽和等電點(diǎn)的差異，設(shè)計(jì)兩套純化方案制備高純度IL24重組蛋白。將純化的IL24蛋白經(jīng)注射途徑免疫家兔，獲得兔抗IL24抗血清，采用免疫雙擴(kuò)、ELISA及WESTERNBLOT檢測(cè)IL24多抗的免疫反應(yīng)性。3）人白細(xì)胞介素24基因在畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定為避免在目的蛋白的N端引入26個(gè)多余的氨基酸，利用載體PPIC9K上的羧肽酶BKEX2識(shí)別位點(diǎn)編碼堿基之前的XHOⅠ和多克隆位點(diǎn)中的ECⅠ，將HIL24插入到PPIC9K中，構(gòu)建以Α因子為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒IL24PPIC9K。以及將HMIL24插入到PPIC9K上Α因子編碼堿基之前的BAMHⅠ和多克隆位點(diǎn)中的ECⅠ之間，構(gòu)建以自身信號(hào)肽為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒MIL24PPIC9K。采用體內(nèi)篩選法獲得多拷貝重組工程菌IL24PPIC9KPICHIA和MIL24PPIC9KPICHIA。利用載體PAO815體外構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒N（AOXΑIL24）PAO815，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得多拷貝重組工程菌N（AOXΑIL24）PAO815PICHIA。甲醇誘導(dǎo)三種重組畢赤酵母工程菌表達(dá)RIL24。用SDSPAGE、ELISA和WESTERNBLOT鑒定酵母表達(dá)產(chǎn)物，用糖苷酶PNGASEF分析產(chǎn)物的糖基化特點(diǎn)。4）重組HIL24生物學(xué)活性鑒定采用MTT比色法，形態(tài)學(xué)觀察、DANLADDER實(shí)驗(yàn)，凋亡相關(guān)蛋白BAX含量變化分析以及ANNEXINVPI流式細(xì)胞術(shù)，分析大腸桿菌表達(dá)純化的TRXIL24和IL24，以及酵母分泌表達(dá)的RIL24體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。研究結(jié)果1）克隆出帶信號(hào)肽的HIL24編碼序列（HMIL24）和不帶信號(hào)肽的HIL24編碼序列（HIL24）。并發(fā)現(xiàn)4份標(biāo)本中，僅有1份HIL24的序列測(cè)定結(jié)果與GENBANK公布的一致。其余3份均在同一位置第370BP處發(fā)生堿基的點(diǎn)突變，即T→C，該堿基的突變會(huì)帶來氨基酸的改變（TYR→HIS）。2）重組大腸桿菌PET32AHIL24ECOLIBL21DE3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白TRXIL24，分子量約為35KD，主要以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白的30％。包涵體經(jīng)洗滌，在PH90的8M尿素中溶解。在變性條件下，采用二步法純化，得到純度為9197％的TRXIL24。用腸激酶酶切融合蛋白TRXIL24得到TRX和IL24兩個(gè)多肽段，利用兩個(gè)多肽段等電點(diǎn)的差異，最終確定了包涵體洗滌→溶解→復(fù)性→酶切→陽離子交換層析純化的方案，并制備出純度為9571％的IL24。N端氨基酸測(cè)序證實(shí)重組IL24酶切完全，N端無多余氨基酸。IL24免疫動(dòng)物所獲得的抗血清，經(jīng)免疫雙擴(kuò)檢驗(yàn)效價(jià)為132，ELISA檢測(cè)滴度為600000EU，WESTERNBLOT證實(shí)兔抗IL24多抗能夠與不同來源的重組蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。3）體內(nèi)篩選出5株、具有46個(gè)表達(dá)盒拷貝的重組工程菌IL24PPIC9KPICHIA，其中3株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)RIL24，最高表達(dá)量約8131±1446MGL。體內(nèi)篩選出5株、具有46個(gè)拷貝的重組工程菌MIL24PPIC9KPICHIA，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)均無RIL24分泌表達(dá)。體外構(gòu)建6株的具有16個(gè)表達(dá)盒拷貝的重組工程菌16（AOXΑIL24）PAO815PICHIA，其中3株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)RIL24，最高表達(dá)量約9593±1872MGL。重組畢赤酵母工程菌分泌表達(dá)的RIL24蛋白發(fā)生了N糖基化修飾，分別在184KD和24KD位置出現(xiàn)SDSPAGE條帶和WESTERNBLOT條帶，糖肽酶PNGASEF處理后24KD條帶消失。4）通過體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了TRXIL24、IL24和RIL24均具有體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，且對(duì)正常細(xì)胞沒有影響，酵母細(xì)胞表達(dá)的RIL24誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于大腸桿菌表達(dá)的TRXIL24和IL24，提示了適當(dāng)?shù)暮笮揎椨欣谥亟M蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)論本研究克隆出編碼人白細(xì)胞介素24的基因。HIL24基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中融合表達(dá)，建立融合蛋白TRXIL24的分離、純化和復(fù)性中試工藝。制備出無多余氨基酸的IL24，建立IL24的分離和純化工藝，并獲得具有較好免疫反應(yīng)性的兔抗人IL24多抗。實(shí)現(xiàn)HIL24基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)，分泌表達(dá)重組蛋白R(shí)IL24具有適度的N糖基化。TRXIL24、IL24和RIL24均具有體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，且對(duì)正常細(xì)胞沒有影響，RIL24誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于TRXIL24和IL24，證實(shí)畢赤酵母（真核）表達(dá)系統(tǒng)更利于重組蛋白的生物學(xué)活性。

簡(jiǎn)介：本研究的第一部分旨在研究胎兒體內(nèi)多種組織中是否與骨髓一樣存在有胚胎后亞全能干細(xì)胞通過運(yùn)用CD45、GLYA及CD34免疫磁珠分選和極限稀釋法從胎兒骨髓中得到一FLK1CD31CD34的多能干細(xì)胞亞群在單細(xì)胞水平上該細(xì)胞體外可向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝上皮樣細(xì)胞及造血細(xì)胞紅系定向分化在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上我們又相繼從胎兒的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉、真皮中分離到一干細(xì)胞亞群在第二部分我們研究了胎兒骨髓源FLK1CD31CD34多能干細(xì)胞是否能作為組織工程中用的種子細(xì)胞參與機(jī)體內(nèi)多種組織的損傷修復(fù)結(jié)果顯示胎兒骨髓源FLK1CD31CD34細(xì)胞具有高度的分化潛能在經(jīng)亞致死量照射的非肥胖型糖尿病及嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷NODSCID小鼠體內(nèi)不僅有助于造血重建分化為造血細(xì)胞參與體內(nèi)血管新生及微血管損傷的修復(fù)還能分化為氣管、肺、消化道的上皮細(xì)胞以及有功能的肝細(xì)胞二次移植植入第二受體后仍能夠分化為造血、內(nèi)皮、上皮和肝細(xì)胞更進(jìn)一步提示胎兒骨髓源FLK1CD31CD34細(xì)胞輸屬于一類種原始干細(xì)胞群體很可能成為一種理想的種子細(xì)胞可作為造血干細(xì)胞移植中CD34造血干細(xì)胞的替代品及用于治療一些遺傳及退行性疾病本論文的第三部分旨在進(jìn)一步探討能否從血管壁中分離到多能干細(xì)胞我們的結(jié)果顯示在胎兒的肺動(dòng)脈管壁中存在有多角型或成纖維樣、免疫表型與胎兒骨髓源FLK1CD31CD34細(xì)胞一致、血管內(nèi)皮及血管平滑肌細(xì)胞表面標(biāo)志陰性的一類干祖細(xì)胞我們稱其為FLK1CD31ΑSMA細(xì)胞

簡(jiǎn)介：自二十世紀(jì)八十年代起，特別是1998年人胚胎干細(xì)胞建立以后，人們?cè)絹碓街匾暩杉?xì)胞在治療一些難治性疾病方面的應(yīng)用，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS疾病、心血管疾病和糖尿病。在干細(xì)胞移植治療方面，人們已嘗試過胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等治療相關(guān)疾病，并取得了一定的療效，但胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞在臨床上應(yīng)用還面臨很多問題，如安全性、免疫排斥反應(yīng)、細(xì)胞來源有限以及倫理道德等，嚴(yán)重阻礙了干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物羊膜內(nèi)也存在干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有多分化潛力，并且有人報(bào)道羊膜干細(xì)胞的增殖能力要高于骨髓來源的干細(xì)胞。羊膜干細(xì)胞AMNIOTICSTEMCELLS的發(fā)現(xiàn)和研究為上述干細(xì)胞臨床應(yīng)用存在的問題提供了一種可行的解決途徑。羊膜干細(xì)胞來源于羊膜AMNION，也可稱作胎膜，是與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物，是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜干細(xì)胞主要分布在羊膜的上皮層和基底層，可表達(dá)早期干細(xì)胞的一些不同標(biāo)記，如OCT4，堿性磷酸酶AKP，神經(jīng)細(xì)胞特異的膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白GFAP，神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP2以及神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記NESTIN，肝薄壁組織細(xì)胞蛋白等，說明既然羊膜形成于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的干細(xì)胞，仍保留多分化潛能。同時(shí)人羊膜干細(xì)胞還具有以下一些特點(diǎn)1自身缺乏主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ類抗原，如HLAA，B，C和DR以及B2免疫球蛋白，移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，同時(shí)人羊膜細(xì)胞又表達(dá)HLAE、G抗原，使其具有免疫抑制活性。2人羊膜細(xì)胞來源非常廣泛，不會(huì)產(chǎn)生倫理或者道德的問題。3不具致瘤性。人們已做了大量的研究工作證明了人羊膜干細(xì)胞治療疾病的潛力ZHAO等人發(fā)現(xiàn)人羊膜干細(xì)胞移植入心臟后，分化成心肌樣細(xì)胞；SAKURAGAWA等人報(bào)道了羊膜上皮細(xì)胞能有效抑制PD大鼠多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的退變，并且使大鼠的疾病行為明顯改善；HIDEIOKAWA等將大鼠羊膜上皮細(xì)胞作為供體細(xì)胞移植到腦缺血模型鼠的海馬中，發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞以類似于CA錐體層神經(jīng)元的方式存活，這一重要結(jié)果提示羊膜細(xì)胞有轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞的可能，并且具有治療缺血性腦損傷的潛能；SANKAR等發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞能部分恢復(fù)脊髓損傷；WEI等報(bào)道羊膜上皮細(xì)胞能使糖尿病鼠的血糖水平恢復(fù)正常，羊膜上皮細(xì)胞在體內(nèi)有潛力分化成Β胰島細(xì)胞，提示羊膜上皮細(xì)胞有治療糖尿病的潛力等等。人們還有利用人羊膜細(xì)胞作為基因治療的工程性細(xì)胞載體，來治療一些遺傳性疾病，如黏多糖貯積?、鳌⒓易逍愿吖檀佳Y遺傳性肝臟疾病等，也取得不錯(cuò)的效果。在我國(guó)，上海中科院細(xì)胞研究所已建立和完善了羊膜干細(xì)胞的培養(yǎng)平臺(tái)和羊膜細(xì)胞基因改造平臺(tái)，并在上述基礎(chǔ)之上，開展了羊膜干細(xì)胞治療疾病的多項(xiàng)動(dòng)物研究，包括以帕金森病為代表的神經(jīng)退行性疾病的治療，以腦缺血為主的腦損傷治療，以脊髓損傷為主的神經(jīng)再生治療，以耳毛細(xì)胞再生為主的神經(jīng)性耳聾治療以及糖尿病治療等，并取得了初步的成果。目前已完成了羊膜干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因羊膜干細(xì)胞治療腦缺血性疾病的臨床前試驗(yàn)工作，結(jié)果表明羊膜干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因羊膜干細(xì)胞對(duì)腦缺血性疾病具有很好的治療作用。以上眾多的有關(guān)人類羊膜細(xì)胞的基礎(chǔ)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明該細(xì)胞有廣闊的臨床應(yīng)用前景，羊膜及其所包含的細(xì)胞如果再結(jié)合組織工程技術(shù)，將能開發(fā)出各種生物產(chǎn)品以滿足臨床各種疾病治療的需求。本研究著重從羊膜細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化、神經(jīng)修復(fù)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)移植免疫等方面進(jìn)行探討，為臨床上應(yīng)用羊膜細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)創(chuàng)傷作前期準(zhǔn)備。第一部分人羊膜上皮細(xì)胞與人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的比較目的比較人羊膜上皮細(xì)胞AECS與人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞AMSCS體外分離培養(yǎng)方法及兩種細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法采取酶消化法分離人羊膜細(xì)胞，利用兩種細(xì)胞居于羊膜組織的不同層次及與羊膜基質(zhì)不同的附著力各自進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)并作比較性分析，同時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，自二十世紀(jì)八十年代起，特別是1998年人胚胎干細(xì)胞建立以后，人們?cè)絹碓街匾暩杉?xì)胞在治療一些難治性疾病方面的應(yīng)用，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS疾病、心血管疾病和糖尿病。在干細(xì)胞移植治療方面，人們已嘗試過胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等）治療相關(guān)疾病，并取得了一定的療效，但胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞在臨床上應(yīng)用還面臨很多問題，如安全性、免疫排斥反應(yīng)、細(xì)胞來源有限以及倫理道德等，嚴(yán)重阻礙了干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物羊膜內(nèi)也存在干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有多分化潛力，并且有人報(bào)道羊膜干細(xì)胞的增殖能力要高于骨髓來源的干細(xì)胞。羊膜干細(xì)胞AMNIOTICSTEMCELLS的發(fā)現(xiàn)和研究為上述干細(xì)胞臨床應(yīng)用存在的問題提供了一種可行的解決途徑。羊膜干細(xì)胞來源于羊膜AMNION，也可稱作胎膜，是與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物，是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜干細(xì)胞主要分布在羊膜的上皮層和基底層，可表達(dá)早期干細(xì)胞的一些不同標(biāo)記，如OCT4，堿性磷酸酶AKP，神經(jīng)細(xì)胞特異的膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白GFAP，神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP2以及神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記NESTIN，肝薄壁組織細(xì)胞蛋白等，說明既然羊膜形成于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的干細(xì)胞，仍保留多分化潛能。同時(shí)人羊膜干細(xì)胞還具有以下一些特點(diǎn)1自身缺乏主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ類抗原，如HLAA，B，C和DR以及Β2免疫球蛋白，移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，同時(shí)人羊膜細(xì)胞又表達(dá)HLAE、G抗原，使其具有免疫抑制活性。2人羊膜細(xì)胞來源非常廣泛，不會(huì)產(chǎn)生倫理或者道德的問題。3不具致瘤性。人們已做了大量的研究工作證明了人羊膜干細(xì)胞治療疾病的潛力ZHAO等人發(fā)現(xiàn)人羊膜干細(xì)胞移植入心臟后，分化成心肌樣細(xì)胞；SAKURAGAWA等人報(bào)道了羊膜上將由PHA激發(fā)的T細(xì)胞與AECS和AMSCS共培養(yǎng)，觀察T細(xì)胞與兩者的相互作用。結(jié)果1兩種來源的羊膜細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，呈現(xiàn)不同的形態(tài)外觀，兩種細(xì)胞均高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166，但不表達(dá)CD34、CD45、HLADR。2AMSCS體外能傳代及克隆化培養(yǎng)，AECS則不能，兩種細(xì)胞在體外均能誘導(dǎo)向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化。3兩種來源的羊膜細(xì)胞在體外對(duì)T細(xì)胞的活化增殖有明顯的抑制作用。結(jié)論人類AECS和AMSCS具有類似的體外生物學(xué)特性、表型、多向分化的潛能及其負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，是一類理想的組織工程種子細(xì)胞。第二部分羊膜細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及與絲素蛋白支架構(gòu)建復(fù)合體移植對(duì)大鼠復(fù)合損傷脊髓的修復(fù)作用目的探討體外羊膜細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法，羊膜細(xì)胞在生物支架上的生長(zhǎng)特點(diǎn)，研究種子細(xì)胞移植結(jié)合組織工程化技術(shù)在神經(jīng)修復(fù)中的運(yùn)用前景。方法采用酶消化法分離人羊膜組織，分別進(jìn)行貼壁培養(yǎng)和傳代，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)作比較性分析，鑒定AECS及AMSCS，并在誘導(dǎo)劑作用下進(jìn)行細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)向少枝膠質(zhì)細(xì)胞方向進(jìn)行分化干預(yù)；構(gòu)建羊膜細(xì)胞與絲素蛋白支架復(fù)合體，找到生物支架有利于羊膜細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的證據(jù)；分組進(jìn)行羊膜細(xì)胞移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，從動(dòng)物行為學(xué)、病理切片、免疫細(xì)胞化學(xué)法、電鏡檢查等多角度了解組織工程化細(xì)胞移植在神經(jīng)修復(fù)方面的積極作用。結(jié)果同是來源于羊膜的兩種細(xì)胞都呈貼壁生長(zhǎng)，但形態(tài)卻迥異，AECS呈鵝卵石樣外觀，邊界清楚，折光性較強(qiáng)，而AMSCS則呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，表面標(biāo)記物表達(dá)的差異在于前者表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK19而不表達(dá)CD49D，后者表達(dá)CD49D而不表達(dá)CK19。人AECS高表達(dá)CD29和CD44說明其具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。羊膜細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后形成少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，多數(shù)表達(dá)GALC，部分表達(dá)MBP。運(yùn)用掃描電鏡觀察體外絲素蛋白支架復(fù)合體細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)支架的三維多孔結(jié)構(gòu)提高了細(xì)胞的粘附和增殖能力，細(xì)胞呈立體化生長(zhǎng)，相互間的突起聯(lián)接更多。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果表明細(xì)胞移植組尤其是結(jié)合支架的復(fù)合移植組動(dòng)物行為功能恢復(fù)遠(yuǎn)較對(duì)照組良好，差異有顯著性。組織病理切片及組化實(shí)驗(yàn)表明移植物同宿主間整合良好，移植細(xì)胞有存活并向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化證據(jù)。神經(jīng)示蹤技術(shù)同樣表明了復(fù)合支架移植組有更佳的神經(jīng)軸索修復(fù)表現(xiàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)了絲素蛋白支架有著良好的組織相容性，植入支架復(fù)合物的損傷脊髓膠質(zhì)疤痕形成明顯減少，獲得了更好的神經(jīng)修復(fù)。結(jié)論羊膜源性干細(xì)胞具有多向分化潛能，體外及在體狀態(tài)都有向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，在生物支架材料上羊膜細(xì)胞呈現(xiàn)良好的立體化擴(kuò)增特點(diǎn)，運(yùn)用羊膜細(xì)胞同絲素蛋白支架構(gòu)建的復(fù)合體移植手術(shù)對(duì)大鼠的脊髓損傷有著更為理想的修復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)在適當(dāng)轉(zhuǎn)化條件下羊膜細(xì)胞可向少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化后的終末端神經(jīng)細(xì)胞并未展示出在神經(jīng)修復(fù)方面有更多優(yōu)勢(shì)，而結(jié)合支架應(yīng)用的組織工程化復(fù)合移植策略明顯有利于軸索再生及髓鞘形成。第三部分人羊膜細(xì)胞負(fù)性協(xié)同刺激分子PDL1表達(dá)的檢測(cè)及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)控作用目的探討人羊膜細(xì)胞負(fù)性協(xié)同刺激分子PDL1的表達(dá)及對(duì)體外小膠質(zhì)細(xì)胞MI的負(fù)性協(xié)同作用。方法用原代培養(yǎng)10天左右的AECS及體外擴(kuò)增3代的AMSCS，采用流式細(xì)胞儀和免疫熒光方法來分析兩種細(xì)胞協(xié)同刺激分子的表達(dá)情況3HTDR摻入法檢測(cè)羊膜細(xì)胞對(duì)脂多糖刺激后的MI增殖的影響，以及PDL1單克隆抗體部分阻斷羊膜細(xì)胞抑制MI增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析羊膜細(xì)胞對(duì)脂多糖作用下MI細(xì)胞周期的影響，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子水平，以及阻斷PDL1作用后的變化。結(jié)果1人AECS及AMSCS均不表達(dá)CD80、CD83、CD86等正性協(xié)同刺激分子，但都較高表達(dá)負(fù)性分子PDL1。2AECS及AMSCS均可抑制MI體外增殖，并使脂多糖刺激下的MI滯留于細(xì)胞周期的G0G1期，以及調(diào)節(jié)TNFΑ、NO等的分泌，由此表明，羊膜細(xì)胞介導(dǎo)的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用部分是通過高表達(dá)PDL1分子，PDL1是羊膜細(xì)胞表達(dá)的主要負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子。結(jié)論人類羊膜細(xì)胞在體外具有對(duì)MI活化和增殖的抑制作用，其表達(dá)的PDL1分子介導(dǎo)了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。