簡介：第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文MIRNA一429對人乳腺癌BCAP37細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控及相關(guān)研究THEROLEOFMIRNA一429ONTHEBIOLOGICALBEHAVIORSOFBREASTCANCERBCAP37CELLSANDTHERELATEDRESEARCH研究生秦科宇專業(yè)名稱外科學(xué)導(dǎo)師姓名盛渡第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院上海長海醫(yī)院二O一五年五月目錄摘要1ABSTRACT4英文縮略詞表6前言7再U吞‘7課題設(shè)計(jì)10材料和方法11一、材料1L二、儀器設(shè)備一11三、實(shí)驗(yàn)方法12結(jié)果18討侖26文獻(xiàn)綜述30參考文獻(xiàn)43在讀期間參加科研工作情況54致謝55

簡介：目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSBMSCS已經(jīng)成為組織工程中重要的的種子細(xì)胞在多種疾病的臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。而若想深入研究BMSCS的存活、增殖、分化及在體內(nèi)的遷移、歸巢情況首先需要解決如何高效、安全地標(biāo)記BMSCS的問題。本文通過觀察SPIO、DAPI和CMDIL對家兔BMSCS的聯(lián)合標(biāo)記效果及其對細(xì)胞存活、增殖以及分化的影響為BMSCS的活體示蹤研究奠定理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法分離培養(yǎng)家兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用SPIO、DAPI和CMDIL聯(lián)合標(biāo)記后采用普魯士藍(lán)染色法檢測SPIO標(biāo)記率熒光顯微鏡檢測熒光標(biāo)記率透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及SPIO在細(xì)胞內(nèi)的分布臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力MTT法檢測細(xì)胞增殖力并使用地塞米松、胰島素、3異丁基一1一甲基黃嘌呤、吲哚美辛體外誘導(dǎo)標(biāo)記細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化并用透射電子顯微鏡鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞使用5一氮雜胞苷體外誘導(dǎo)標(biāo)記細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化并用免疫熒光鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞。結(jié)果SPIO、DAPI和CMDIL在體外對家兔BMSCS的聯(lián)合標(biāo)記率幾乎達(dá)100％透射電鏡下可見電子密度高的SPIO顆粒主要分布于溶酶體、線粒體內(nèi)部及胞內(nèi)其他膜性結(jié)構(gòu)上細(xì)胞核內(nèi)未見分布且聯(lián)合標(biāo)記BMSCS的超微結(jié)構(gòu)顯示清晰、形態(tài)保存良好臺盼藍(lán)拒染法顯示聯(lián)合標(biāo)記BMSCS組的細(xì)胞活力與未標(biāo)記BMSCS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005MTT法檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合標(biāo)記BMSCS組的細(xì)胞增殖力與未標(biāo)記BMSCS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005聯(lián)合標(biāo)記BMSCS經(jīng)地塞米松、胰島素、3異丁基一卜甲基黃嘌呤一吲哚美辛體外誘導(dǎo)后透射電鏡下可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴聯(lián)合標(biāo)記BMSCS經(jīng)5氮雜胞苷體外誘導(dǎo)后免疫熒光鑒定心肌特異性肌鈣蛋白TCTNT陽性。結(jié)論SPIO、DAPI和CMDIL對家兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的聯(lián)合標(biāo)記率高并對其存活、增殖以及分化無影響。

簡介：分類號R373密級不保密UDC610學(xué)校代碼11065碩士學(xué)位論文EB病毒BARF1及其變異型基因改變鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為機(jī)制的初步研究沈智超指導(dǎo)教師王云教授學(xué)科專業(yè)名稱病原生物學(xué)論文答辯日期201562MECHANISMSOFEPSTEINBARRVIRUSENCODEDBARF1ITSVARIANTTOAFFECTTHEBIOLOGICALBEHAVISOFNASOPHARYNGEALCARCINOMACELLLINESABSTRACTBACKGROUNDOBJECTIVETHEEPSTEINBARRVIRUSEBVENCODEDBARF1GENEISCONSIDEREDASONEOFTHEVIRUSONCOGENEITSTRANSFMATIONROLEHASBEENDEMONSTRATEDINVARIOUSCELLLINESBARF1ISFREQUENTLYEXPRESSEDINNASOPHARYNGEALCARCINOMANPCINDICATINGTHATBARF1GENEMAYPLAYANIMPTANTROLEINNPCOURPREVIOUSSTUDYSHOWEDTHATBARF1ITSVARIANTV29AINCREASETHEANTIAPOPTOSISMIGRATIONABILITIESOFNPCCELLLINECNE1THISSTUDYAIMSTOFURTHEREXPLETHEONCOGENICFUNCTIONSOFBARF1ITSVARIANTINEBVNEGATIVENPCCELLLINESHONE1INVESTIGATETHEMECHANISMSOFBARF1TOAFFECTTHEBIOLOGICALBEHAVISOFNPCCELLLINESMETHODSTHECELLBIOLOGICALBEHAVIANALYSISWERECONDUCTEDINCLUDINGMTTASSAYCOLONYFMATIONASSAYANTIAPOPTOSISASSAYCELLMIGRATIONINVASIONASSAYINVIVOTUMIGENICITYTESTINPROTOTYPEBARF1V29AVARIANTBARF1TRANSFECTEDCELLSUNDERTHECONTROLOFLENTIVIRUSVECTTRANSFECTIONGROUPTHEDIFFERENTIALLYEXPRESSEDGENESBETWEENTHEBARF1TRANSFECTEDCELLSTHEVECTTRANSFECTEDCELLSWEREDETECTEDBYCDNAMICROARRAYTECHNIQUEFUNCTIONALONTOLOGIESPATHWAYANALYSISFTHEBARF1MODULATEDGENESWASAPPLIEDTHEBARF1RELATEDCANCERPATHWAYSKEYGENESWEREVALIDATEDINNPCCELLLINESXENOGRAFTTUMSRESULTS1EXPRESSIONOFPROTOTYPEBARF1VARIANTBARF1INHONE1CELLLINESINCREASEDCELLPROLIFERATIONCOLONYFMATIONABILITYP005ENHANCEDTHECELLANTIAPOPTOSISMIGRATIONINVASIONABILITYP005NODIFFERENCEWASFOUNDBETWEENPROTOTYPEVARIANTBARF1EXPRESSINGCELLS2BARF1EXPRESSIONINHONE1CELLSDIDNOTENHANCETHEINVIVOTUMIGENICITYINNUDEMICE3THEPROTOTYPEBARF1VARIANTBARF1TRANSFECTEDCELLSDEMONSTRATEDSIMILAREXPRESSIONPROFILETHEYSHOWED317DIFFERENTIALLYEXPRESSEDGENESCOMPAREDWITHVECTTRANSFECTEDCELLSINCLUDING94UPREGULATEDGENES223DOWNREGULATEDGENESTHEBARF1MODULATEDGENESWEREINVOLVEDINCELLADHESIONCELLSIGNALTRANSDUCTIONCELLAPOPTOSISCELLPROLIFERATIONCELLMIGRATIONINVASIONPARTICIPANTEDINMANYPATHWAYSSUCHASCYTOKINECYTOKINERECEPTINTERACTIONERBBSIGNALINGPATHWAYPATHWAYSINCANCER

簡介：目的通過研究肺動脈高壓PULMONARYARTERIALHYPERTENSION，PAH大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS的增殖、血管形成能力并其探討生物學(xué)特性。為BMSCS移植治療PAH提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法在大鼠腹腔內(nèi)給予10％野百合堿60MGKG注射建立肺動脈高壓模型，按體重注射相應(yīng)體積生理鹽水制作正常組模型MCT注射3周后同時測定PAH組和正常組大鼠肺血流動力學(xué)參數(shù)（平均肺動脈壓）、測左心室LV、室間隔S及右心室RV質(zhì)量，利用RVLVS計(jì)算得到右心室肥厚指數(shù)RVHIHE染色觀察肺小動脈壁結(jié)構(gòu)通過血球自動分析儀測定大鼠靜脈血中的中性粒細(xì)胞百分比密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)PAH組和正常組大鼠BMSCS，倒置顯微鏡下觀察并用照相機(jī)拍照BMSCS形態(tài)用流式細(xì)胞儀儀器檢測細(xì)胞多個表面抗原來綜合鑒定BMSCS，并在體外進(jìn)行血管形成實(shí)驗(yàn)CCK8法測定BMSCS的生長曲線。結(jié)果1野百合堿注射3周后，較正常組大鼠，PAH組大鼠MPAP和RVHI明顯升高P＜001。2靜脈血分析與正常組大鼠相比，PAH組大鼠中性粒細(xì)胞百分比顯著升高P＜001。3HE染色切片顯示PAH組大鼠肺小動脈管壁較正常組大鼠顯著增厚。4流式細(xì)胞儀儀器檢測大鼠BMSCS表面標(biāo)志較正常組大鼠，PAH組大鼠BMSCS陽性表面標(biāo)志CD44、CD90表達(dá)率顯著減少P＜005，陰性表面標(biāo)志CD31、CD34、CD45表達(dá)率顯著增加（P＜005）。5PAH組大鼠BMSCS較正常組大鼠生長增殖能力均明顯下降。6血管形成實(shí)驗(yàn)與正常組大鼠BMSCS比較，PAH組大鼠BMSCS形成血管腔數(shù)顯著減少（P＜001）。結(jié)論1、通過采用在腹腔內(nèi)注射野百合堿的方法成功制作大鼠肺動脈高壓模型。2、PAH大鼠體內(nèi)存在炎癥。3、采用FICOLL密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但PAH組大鼠BMSCS純度低。4、PAH組大鼠BMSCS的生長、增殖及血管形成能力減低。

簡介：蘇州大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名么弘型出7蘇州大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)聲明咖0燦0㈣岫㈣㈣㈣IIIY2121766本人完全了解蘇州大學(xué)關(guān)于收集、保存和使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)位論文著作權(quán)歸屬蘇州大學(xué)。本學(xué)位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。蘇州大學(xué)有權(quán)向國家圖書館、中國社科院文獻(xiàn)信息情報(bào)中心、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所含萬方數(shù)據(jù)電子出版社、中國學(xué)術(shù)期刊光盤版電子雜志社送交本學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。涉密論文口本學(xué)位論文屬在年一月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文口論文作者簽名盤壘日期絲忽』12導(dǎo)師簽名生翌查查日期趁Z至』Z

簡介：復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文NM23H1基因轉(zhuǎn)染對人肝癌7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的初步研究姓名徐伯贏申請學(xué)位級別碩士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師申宗侯20030524第二部分NM23H1對全反式維甲酸誘導(dǎo)的SMMC7721細(xì)胞凋亡及其相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響為了探討NM23一H1與凋亡的關(guān)系，本文研究了NM23一H1轉(zhuǎn)染對全反式維甲酸ATRA誘導(dǎo)的7721細(xì)胞的凋亡的影響。用流式細(xì)胞儀和熒光染色顯示，在ATRA誘導(dǎo)下，NM23～HL／7721細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯增加，表明NM23一HL能促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡。迸一步的研究發(fā)現(xiàn)，在ATRA誘導(dǎo)下，NM23H1／7721細(xì)胞BCL2的表達(dá)沒有發(fā)生明顯改變，PKB的蛋白表達(dá)也沒有發(fā)生顯著變化，但其T308、473位點(diǎn)磷酸化均較MOCK細(xì)胞顯著降低，對抑癌基因P53的檢測表明，P53的MINA水平明顯下降。結(jié)果表明NM23一HL轉(zhuǎn)染對ATRA誘導(dǎo)的7721細(xì)胞的凋亡的影響不是通過下調(diào)BCL2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，有可能是通過上調(diào)P53的表達(dá)，以及降低PKB的T308、473位點(diǎn)磷酸化從而降低PKB的活性，以此增加7721細(xì)胞對ATRA誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。另外，轉(zhuǎn)染NM23HLEDNA后，P53MRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示RIM23一HT可能通過P53途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞NM23一H，，凋亡，全反式維甲酸，PKB，P53，BCL一2第三部分NM23一H1轉(zhuǎn)染后SMMC7721細(xì)胞黏附、遷移能力的變化及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的探討為了研究NM23一HL轉(zhuǎn)染對SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛力的影響，本文測定了轉(zhuǎn)染NM23H1后細(xì)胞黏附、遷移能力的變化，發(fā)現(xiàn)NM23H1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的黏附和遷移能力均顯著降低。為了進(jìn)一步探討其黏附和遷移能力變化的機(jī)制，本文測定了轉(zhuǎn)染細(xì)胞整聯(lián)蛋白亞基值5和BL的表達(dá)。NM23一HI／7721與MOCK細(xì)胞相比，5亞基的蛋白表達(dá)沒有發(fā)生明顯改變；而01亞基的蛋白總量也沒有發(fā)生明顯變化，但NM23一HI／7721細(xì)胞中未成熟的B1亞基即未糖基化的遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MOCK細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白亞基A5和PL的表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NM23一H1CDNA后，細(xì)胞表面A5亞基的表達(dá)也沒有改變；而B1亞基的表達(dá)明顯降低，說明PCDNA3／NM23HL轉(zhuǎn)染后可能影響了H7721細(xì)胞PL亞基的糖基化，從而影響其在細(xì)胞表面的投送。對整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N處

簡介：一、研究背景20世紀(jì)80年代以來，肝移植技術(shù)作為治療終末期肝病的有效手段迅速發(fā)展。近年來，越來越多的學(xué)者贊成肝臟移植術(shù)是治療無肝外轉(zhuǎn)移的肝臟惡性腫瘤患者的一個有效治療方法。肝癌作為肝移植的一個適應(yīng)證，居有重要地位。SSCHT于80年代初統(tǒng)計(jì)世界上最大的4肝移植個中心，共540例，肝惡性腫瘤占139例，居第二位，僅次于肝硬化。截至2005年1月，我國累計(jì)施行肝移植手術(shù)已超過5000例，其中肝癌肝移植約占40％左右。隨著肝移植數(shù)量的增加及經(jīng)驗(yàn)的積累，肝癌肝移植的問題也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。近年肝癌肝移植取得了較好的臨床效果，其治療肝臟惡性腫瘤的療效等同于或優(yōu)于肝切除術(shù)。CHERQUI等研究顯示即使癌灶＞5CM的患者，移植術(shù)后1、3年無癌生存率與小肝癌組移植術(shù)后生存率相近。BISMUTH于1993年報(bào)告60例肝硬化肝癌，分肝切除與肝移植組，3年存活率雖相似50％～47％，但總的無轉(zhuǎn)移存活率移植組為46％，切除術(shù)僅27％P＜005，而在早期小肝癌癌塊1～2個，直徑≤3CM則無轉(zhuǎn)移存活率移植組為83％，切除組僅18％，P＜0001，差異極為顯著。肝癌肝移植術(shù)后免疫抑制方案是目前全球移植界關(guān)注的問題。90年代以來，國內(nèi)外在肝臟移植免疫抑制劑的應(yīng)用已形成以CSA或FK506為主，聯(lián)合硫唑嘌呤和強(qiáng)的松的三聯(lián)用藥規(guī)范。FK506、CSA作為器官移植術(shù)后基本的免疫抑制劑，其對肝癌生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響，一直困擾著臨床肝移植界醫(yī)生。FK506、CSA為鈣神經(jīng)素抑制劑，免疫抑制作用的靶細(xì)胞主要是T細(xì)胞，它們分別與T淋巴細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)受體FKBPFK506BINDINGPROTEIN、環(huán)孢素親和素CYCLOPHILIN，CYP結(jié)合形成的復(fù)合體，與胞漿內(nèi)的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻止NFATC的核內(nèi)轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)一步抑制IL2基因的轉(zhuǎn)錄活性，抑制T細(xì)胞的活動過程，是其發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的根本原因。FK506、CSA對肝癌影響多為臨床觀察，對體外肝癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制探討的研究較少。我們以HEPG2肝癌細(xì)胞為研究對象，通過不同濃度的FK506、CSA作用不同時間，研究對肝癌細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞周期變化及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，應(yīng)用基因芯片技術(shù)和熒光PCR方法，從基因水平探討影向的機(jī)制。二、本課題的研究方案1MTT比色法觀察二者對HEPG2肝癌細(xì)胞生長的影響。2應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)研究二者對HEPG2肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期變化的影響。3應(yīng)用細(xì)胞浸潤實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞浸潤能力變化。4應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選FK506、CSA影響的基因，從基因水平探討影響的機(jī)制。5熒光PCR方法進(jìn)一步探討影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基因在不同濃度下對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響。第一部分他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細(xì)胞生長的影響目的觀察不同濃度的他克莫司與環(huán)孢素A對肝癌的增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響。方法1噻唑藍(lán)MTT比色法細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)FK506濃度分別為1、5、10、50、100、500ΜGL，CSA濃度設(shè)為5、10、50、100、500、1000ΜGL。同時設(shè)無藥對照組。分別于加藥第24、48、72H取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT5GL20ΜL，37℃繼續(xù)孵育4H后棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜DMSO150ΜL，微量振蕩器振蕩5MIN，用全自動酶標(biāo)儀檢測波長570NM時的吸光度值。32流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、PCNA、細(xì)胞周期。結(jié)果1FK506作用48H、72H肝癌細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，當(dāng)濃度大于100ΜGL，F(xiàn)K506對肝癌細(xì)胞抑制作用不明顯。2CSA處理48H、72H后肝癌細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。3FK506在150ΜGL及CSA在10500ΜGL，作用4872H，凋亡率明顯增加，隨濃度增加，凋亡率增加，呈濃度依賴依賴關(guān)系，超過一定該濃度時，則出現(xiàn)凋亡率減低。4FK506在150ΜGL對HEPG2細(xì)胞作用48H，細(xì)胞周期S期縮短和G1G0期延長，對細(xì)胞周期影響主要為阻滯于G1G0期。CSA對細(xì)胞周期無影響。5FK506在150ΜGL及CSA在10500ΜGLPCNA表達(dá)顯著減低。第二部分基因芯片研究他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細(xì)胞基因的影響目的應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細(xì)胞基因的影響。方法1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)組1CSA為300ΜGL，實(shí)驗(yàn)組2K506設(shè)為20ΜGL，未加藥物者為對照組。HEPG2細(xì)胞分別經(jīng)過處理48H后檢測取細(xì)胞標(biāo)本行基因芯片。2基因芯片在深圳微芯公司實(shí)驗(yàn)中心檢測。具體方法如下總RNA提取、探針標(biāo)記、芯片雜交、芯片掃描、圖像結(jié)果分析、數(shù)據(jù)處理、報(bào)表生成。結(jié)果1在CSA組中具有比較明顯的功能類別特征的基因變化是蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，提示蛋白質(zhì)合成受到抑制；2在FK506組中比較突出的表達(dá)變化基因類型為與細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)的基因，提示實(shí)驗(yàn)組樣品細(xì)胞存在細(xì)胞增殖的抑制以及細(xì)胞凋亡的增加。第三部分他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細(xì)胞的浸潤能力影響目的探討他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細(xì)胞的浸潤能力影響。方法1以HEPG2肝癌細(xì)胞為研究對象，F(xiàn)K506濃度分別為1、5、10、20、50、100ΜGL，CSA濃度為5、10、50、100、300、500ΜGL，每一濃度各設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)無藥對照組3孔，經(jīng)48H處理后行熒光光定量PCR的檢測。2細(xì)胞浸潤實(shí)驗(yàn)FK506和CSA處理48H的細(xì)胞加入無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1824H；PBS洗滌細(xì)胞2次，025％胰酶消化后，收集懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到02510106ML；取100UL細(xì)胞懸液加到浸潤膜上，37℃孵育30分鐘；每孔加入175配好的CYQUANTGR染色劑50UL，室溫孵育15分鐘，96孔板及浸潤膜取去，行共聚焦顯微鏡檢測，測定平均熒光強(qiáng)度。3熒光光定量PCR的檢測設(shè)計(jì)引物和探針、細(xì)胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果1細(xì)胞浸潤實(shí)驗(yàn)顯示FK506在120ΜGL及CSA在5300ΜGL作用48H，肝癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對照組無明顯變化，超過上述濃度范圍肝癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度較對照組明顯增強(qiáng)。2熒光PCR檢測FK506在120ΜGL，ICAM、MMP基因拷貝數(shù)與對照組無明顯差別，F(xiàn)K506濃度超過50ΜGL表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)明顯增加，CSA與FK506表現(xiàn)為類似的反應(yīng)。全文結(jié)論1FK506、CSA對HEPG2肝癌細(xì)胞有生長抑制作用，使細(xì)胞增殖能力降低，在一定濃度和作用的時間下表現(xiàn)為促細(xì)胞凋亡作用。2FK506使細(xì)胞周期阻滯于G0G1期，CSA對細(xì)胞周期無影響。3在CSA組中具有比較明顯的功能類別特征的表達(dá)變化基因主要包括與蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)；在FK506組中比較突出的表達(dá)變化基因類型為與細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)的基因，提示實(shí)驗(yàn)組樣品細(xì)胞存在細(xì)胞增殖的抑制以及細(xì)胞凋亡的增加。4與對照組比較，細(xì)胞浸潤能力在低濃度下無影響，高濃度下有促腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

簡介：點(diǎn)擊查看更多1、狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性、凍存技術(shù)及示蹤方法的實(shí)驗(yàn)研究2、右歸飲聯(lián)合干細(xì)胞介入治療早期股骨頭缺血性壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：胰腺癌是消化系統(tǒng)中預(yù)后最差的腫瘤之一，即使接受根治性切除術(shù)后的患者其5年生存率也只有5～10。因而深入闡明胰腺癌發(fā)生機(jī)制，尋找胰腺癌治療的新靶點(diǎn)對于改善預(yù)后具有重要意義。最新研究認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，是由少數(shù)具有成瘤能力的腫瘤干細(xì)胞增殖發(fā)育而成的異常組織。近年來國內(nèi)外學(xué)者通過特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志已在急性髓細(xì)胞樣白血病、乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中成功分離出相應(yīng)的腫瘤干細(xì)胞，并證明它們在腫瘤的形成和生長過程中的決定性作用。亦有學(xué)者從事胰腺癌干細(xì)胞的分離鑒定，但迄今尚未確定出公認(rèn)的表面標(biāo)志物。LI等通過鑒定提出CD44CD24ESA的細(xì)胞亞群是胰腺癌干細(xì)胞，HERMANN等認(rèn)為胰腺癌干細(xì)胞的表型是CD133。另外，他們的研究主要是證明胰腺癌是由腫瘤干細(xì)胞形成的，調(diào)控其生長增殖的信號通路尚未報(bào)道。腫瘤SP細(xì)胞的分離鑒別是被一致公認(rèn)的研究腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的替代方法。本研究采用流式分析證實(shí)了胰腺癌中SP細(xì)胞的存在，通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究其包括干細(xì)胞特性在內(nèi)的生物學(xué)特性，并初步探討了PI3KMT信號通路對其生存增殖的調(diào)控作用。第一部分胰腺癌SP細(xì)胞的分離和表型分析目的分離胰腺癌中的SP細(xì)胞亞群并確定其表型。方法應(yīng)用HOECHST33342染色，流式細(xì)胞儀檢測6個胰腺癌細(xì)胞系及3個原代培養(yǎng)的臨床胰腺癌標(biāo)本中SP細(xì)胞的含量。選取典型的具SP細(xì)胞的細(xì)胞系檢測SP細(xì)胞的表型。結(jié)果除了BXPC3，其他胰腺癌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)標(biāo)本都存在VERAPAMIL敏感的SP細(xì)胞。PANC1、CAPAN1、ASPC1、PC3和SW1990中SP細(xì)胞的比例分別為78422，1688，043和225。3個臨床標(biāo)本中SP細(xì)胞的比例分別為033279和098。PANC1、CAPAN1和ASPC1中的絕大多數(shù)SP細(xì)胞的表型為CD133和CD44CD24ESA結(jié)論胰腺癌中的確存在SP細(xì)胞，其表型為CD133和CD44CD24ESA。第二部分胰腺癌干細(xì)胞樣SP細(xì)胞生物學(xué)特性及化療耐藥機(jī)制初探目的分離鑒定胰腺癌干細(xì)胞樣的SP細(xì)胞亞群并探討其生物學(xué)特性及化療耐藥機(jī)制。方法應(yīng)用HOECHST33342染色，F(xiàn)ACS分選胰腺癌細(xì)胞系PANC1中的SP細(xì)胞。通過平板克隆形成試驗(yàn)和NODSCID小鼠異種移植成瘤試驗(yàn)比較SP細(xì)胞與NONSP細(xì)胞的克隆形成能力及成瘤能力，通過對體外培養(yǎng)的SP細(xì)胞和SP細(xì)胞衍生腫瘤的HOECHST33342復(fù)染SP再分析判斷其是否具有分化潛能。通過成球?qū)嶒?yàn)評價SP細(xì)胞的自我更新能力。采用TRANSWELL試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)比較分選的SP細(xì)胞與NONSP細(xì)胞的侵襲能力及其對化療藥物的耐藥性。應(yīng)用實(shí)時定量PCR檢測SP細(xì)胞與NONSP細(xì)胞中ABCB1和ABCG2的表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)比較SP細(xì)胞與NONSP細(xì)胞的細(xì)胞周期。結(jié)果PANC1SP細(xì)胞具有較高的自我更新能力和成瘤能力并且能夠發(fā)生不對稱分裂生成NONSP細(xì)胞。SP細(xì)胞的侵襲力及其對化療藥物的耐藥性明顯高于NONSP細(xì)胞。SP細(xì)胞中ABCB1和ABCG2的表達(dá)水平明顯高于NONSP細(xì)胞且大多數(shù)細(xì)胞處于G1期。結(jié)論胰腺癌SP細(xì)胞富集了具有高侵襲能力的干細(xì)胞樣腫瘤起始細(xì)胞，其耐藥機(jī)制可能與其大多數(shù)細(xì)胞處于靜息期及某些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)相關(guān)。第三部分PI3KMT信號通路參與胰腺腫瘤干細(xì)胞樣SP細(xì)胞生存增殖的調(diào)控目的分離鑒定胰腺癌中腫瘤干細(xì)胞樣的SP細(xì)胞亞群并探討PI3KMT信號通路對其生存與增殖的調(diào)控。方法應(yīng)用流式分析檢測胰腺癌細(xì)胞系PANC1中SP細(xì)胞的含量。觀察加入PI3KMT信號通路特異性抑制劑LY294002或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC1中SP細(xì)胞的含量變化。采用MTT試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)檢測LY294002或雷帕霉素對分選的SP細(xì)胞和NONSP細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果加入LY294002或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC1SP細(xì)胞的含量明顯降低（LY294002，760±027VS190±022，P0000；雷帕霉素，760±027VS114±020，P0000）。LY294002對SP細(xì)胞和NONSP細(xì)胞的生存抑制率（1細(xì)胞存活率）分別是4787±382和2764±209，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0001）。雷帕霉素對SP細(xì)胞的生存抑制率亦高于NONSP細(xì)胞（5704±278VS3599±311，P0001）。LY294002和雷帕霉素對SP細(xì)胞的克隆形成能力的抑制率也高于NONSP細(xì)胞（LY294002，54±656VS3467±306，P001；雷帕霉素，48±361VS3067±321，P0003。結(jié)論P(yáng)I3KMT信號通路參與對其生長增殖的調(diào)控，可能成為根治胰腺癌的治療新靶點(diǎn)。

簡介：研究背景ΝΚΤ（NATURALKILLERT細(xì)胞是一群細(xì)胞表面既有T細(xì)胞受體TCR，又有NK細(xì)胞受體的特殊T細(xì)胞亞群。該群細(xì)胞具有抗感染，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等多重功能。雖然共表達(dá)T細(xì)胞受體和NK細(xì)胞受體可以作為NKT細(xì)胞的表型指標(biāo)，但是NKT細(xì)胞是一個復(fù)雜的異質(zhì)性群體，其確切的定義仍未取得一致意見。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)CD3CD56NKT細(xì)胞是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CYTOKINEINDUCEDKILLER，CIK中的主要效應(yīng)細(xì)胞，其含量的多少與CIK的細(xì)胞毒活性的高低有關(guān)。目前CIK過繼免疫治療腫瘤的方法在臨床已得到應(yīng)用，但是針對結(jié)核病的細(xì)胞過繼免疫療法還很少研究。由于結(jié)核病的致病菌結(jié)核桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體對它的消滅也依賴細(xì)胞免疫，所以有關(guān)結(jié)核病的細(xì)胞過繼免疫療法的研究有望成為攻克結(jié)核病的一個全新的領(lǐng)域。目的從活化規(guī)律、細(xì)胞數(shù)量、表型和分泌細(xì)胞因子四方面比較正常人與肺結(jié)核病人新鮮外周血中CD3CD56NKT細(xì)胞的差異；分別觀察正常人與肺結(jié)核病人PBMCPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLS用RHIL2刺激后CD3CD56NKT細(xì)胞的增殖規(guī)律，再從細(xì)胞數(shù)量、表型和分泌細(xì)胞因子三方面比較正常人與肺結(jié)核病人RHIL2擴(kuò)增后的CD3CD56NKT細(xì)胞的差異，以期為探討肺結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制和治療方法開辟一個新的道路。方法1淋巴細(xì)胞各亞群的檢測方法正常人與肺結(jié)核病人外周靜脈血收集于肝素鈉抗凝的真空采血管內(nèi)，于4小時內(nèi)完成流式抗體染色處理過程，利用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，最終得出淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)值。2活化指標(biāo)CD69的檢測方法密度梯度離心法獲取外周血單個核細(xì)胞PBMC，用RHIL2刺激PBMC，分別于刺激后0、8、16、40和64小時檢測NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞表面CD69的表達(dá)情況。3RHIL2擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法密度梯度離心法獲取外周血單個核細(xì)胞PBMC，加入RHIL2刺激培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞PBMC，以后每23天補(bǔ)充RHIL2和新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞兩周，分別于培養(yǎng)第0、6、10和14天檢測NKT細(xì)胞比例并計(jì)數(shù)。4NKT細(xì)胞的表型和胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測于培養(yǎng)第0天和第14天收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測NKT細(xì)胞的表面分子ΓΔTCR、CD4、CD8和CD161的表達(dá)情況以及胞內(nèi)細(xì)胞因子IFNΓ、IL4、TNFΑ和IL17的分泌量。結(jié)果1肺結(jié)核病人N42與正常人N30相比，NKT細(xì)胞和TH細(xì)胞比例未發(fā)生顯著變化，NK細(xì)胞比例顯著增加P2PBMC經(jīng)RHIL2刺激0H、8H、16H、40H和64H后，正常人NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞表面CD69表達(dá)量均顯著增加（與0H比較，P005），其余各時間點(diǎn)表達(dá)量均高于正常組（P005），其余各時間點(diǎn)表達(dá)量均高于正常組（P3正常人PBMC在RHIL2刺激培養(yǎng)14天后，細(xì)胞總數(shù)由（086±018）106擴(kuò)增到（3828±456）106（P4正常人外周血中NKT細(xì)胞高表達(dá)CD8，擴(kuò)增后的NKT細(xì)胞則高表達(dá)ΓΔTCR、CD161；結(jié)核病人外周血中NKT細(xì)胞CD8表達(dá)量低于正常人，擴(kuò)增后NKT細(xì)胞ΓΔTCR降低，CD8、CD4、CD161的表達(dá)量則增高，ΓΔTCR、CD4的表達(dá)量低于正常人，CD8、CD161的表達(dá)量則高于正常人。5正常人外周血中NKT細(xì)胞能夠分泌IFNΓ、TNFΑ、IL4和IL17，擴(kuò)增后NKT細(xì)胞分泌IFNΓ、TNFΑ的量顯著增加；肺結(jié)核病人外周血中NKT細(xì)胞也能夠分泌IFNΓ、TNFΑ、IL4和IL17，但擴(kuò)增前后這些細(xì)胞因子的量無差異；正常人擴(kuò)增后的NKT細(xì)胞分泌IFNΓ、TNFΑ的量顯著高于肺結(jié)核病人。結(jié)論1肺結(jié)核病人的T細(xì)胞、ΓΔT細(xì)胞、TC細(xì)胞和B細(xì)胞低于正常人，NK細(xì)胞、THTC比值高于正常人，而NKT細(xì)胞、TH細(xì)胞則與正常人相似。2肺結(jié)核病人NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞的活化均高于正常人。3肺結(jié)核病人的NKT細(xì)胞增殖應(yīng)答低于正常人。4肺結(jié)核病人NKT擴(kuò)增后的ΓΔT細(xì)胞比例比正常人低。5肺結(jié)核病人的IFNΓ、TNFΑ產(chǎn)生低于正常人。

簡介：授一予單位代碼學(xué)號或申請?zhí)柮芗?14592川64091公開文學(xué)論大位州學(xué)鄭士碩專業(yè)學(xué)位NOFCHL過表達(dá)對宮頸癌HELA細(xì)胞生物學(xué)特性的影響院系名稱別名位類者姓學(xué)作導(dǎo)師姓名、職稱基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士王丹郡文海教授呂玉民研究員2009年05月鄭州大學(xué)2009屆碩士學(xué)位論文中文摘要當(dāng)NOTCHL信號被阻斷后，在T細(xì)胞急性淋巴白血病TALL中發(fā)生細(xì)胞靜止，表明對NOTCHL信號的調(diào)控是一種治療腫瘤的有效的方法。另外，現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)，異常的NOTCHL信號在其它類型的白血病和粘液表皮樣瘤中起著十分重要的作用。NOTCHL作為致癌基因或抑癌基因取決于不同類型的細(xì)胞。對NOT。HL信號途徑了解的增多將有助于利用NOTCHL作為分子靶點(diǎn)治療癌癥。然而，關(guān)于NOTCHL信號途徑與宮頸癌相互作用關(guān)系的報(bào)道尚無定論性的結(jié)果。為了更清楚理解NOTCHL信號途徑與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系，本研究首先通過構(gòu)建真核表達(dá)載體，研究NOTCHL的過表達(dá)在宮頸癌中的作用，并通過CCK一8試劑研究過表達(dá)NOTCHL對宮頸癌HELA細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)研究過表達(dá)NOTCHL對宮頸癌HELA細(xì)胞周期及凋亡的影響，最后通過BOYDENCHAMBER研究其對浸潤轉(zhuǎn)移的影響，該研究旨在為以NOTCHL信號途徑為靶點(diǎn)宮頸癌基因治療的提供理論依據(jù)。方法1、從胎盤組織中提取總RNA，經(jīng)RL’PCR擴(kuò)增人NOTCHL胞內(nèi)區(qū)全長，利用及初11和方去AL分別對PCR產(chǎn)物和PEDNA31進(jìn)行雙酶切。用T4DNA連接酶分別連接上述回收的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞，涂板，過夜培養(yǎng)，挑克隆，提質(zhì)粒，雙酶切鑒定。2、真核表達(dá)載體PCDNANICD通過脂質(zhì)體LIP。介CTAMINE2000轉(zhuǎn)染宮頸癌HELA細(xì)胞，并利用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。3、采用半定量RL’PER和WESTEMBLOTTING分析轉(zhuǎn)染前后NOTCHL和HESLMRNA和蛋白表達(dá)的變化。4、采用CCK一8檢測試劑盒分析過表達(dá)NOTCHL對細(xì)胞增殖的影響。5、利用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期及凋亡的變化。6、BOYDENCHAMBER實(shí)驗(yàn)計(jì)算各組穿膜的細(xì)胞數(shù)以比較轉(zhuǎn)染NOTCHL基因?qū)?xì)胞侵襲能力的影響。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理RL’PCR和WESTEMBLOTTING結(jié)果均采用GEOOLS軟件進(jìn)行灰度值分析，上述試驗(yàn)均分別重復(fù)三次。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差X士S表示，行單因素方差分析ONE一WAYANOVA，尸DOS具顯著性。

簡介：第一部分一、目的證實(shí)肝硬化組織中存在人肝臟祖細(xì)胞HPCS，探討HPCS分布及激活的強(qiáng)度與肝臟炎癥程度的關(guān)系提供HPCS向肝細(xì)胞分化的依據(jù)。方法對30例肝硬化及3例正常組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察，對門脈炎癥程度進(jìn)行評分，并用膽管上皮標(biāo)志CK7和肝星狀細(xì)胞激活標(biāo)志SMA進(jìn)行免疫組化染色，對符合HPCS、中間型肝細(xì)胞以及小管樣反應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和半定量評分。結(jié)果在正常肝組織中無門脈周圍HPCS和小管樣反應(yīng)增殖。在肝硬化組織中，增殖的HPCS起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCS及小管樣反應(yīng)從肝硬化結(jié)節(jié)周圍向肝實(shí)質(zhì)擴(kuò)散并出現(xiàn)中間型肝細(xì)胞增殖，其周圍有顯著的肝星狀細(xì)胞激活。HPCS及小管樣反應(yīng)增殖程度隨著門脈炎癥程度的加重而增加。HPCS數(shù)目與中間型肝細(xì)胞數(shù)目之間存在正直線相關(guān)。ALT和AST與HPCS及中間型肝細(xì)胞數(shù)目存在正直線相關(guān)。結(jié)論在人肝硬化中存在祖細(xì)胞的激活，炎癥反應(yīng)是HPCS激活的觸發(fā)因素，HPCS向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)遷移并向肝細(xì)胞方向分化是肝再生的重要途徑。第一部分二、目的研究不同肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物在人肝硬化組織中的定位和分布，明確肝臟祖細(xì)胞群的免疫表型特征。方法用OV6，CK7，CK19，HEPATOCYTE，CKIT以及AFP對30例肝硬化及3例正常肝組織進(jìn)行免疫組化染色和激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)，觀察這些標(biāo)志物在不同細(xì)胞群中的分布。結(jié)果正常肝臟中，膽管和膽小管上皮CK7及CK19陽性，OV6及CKIT陰性。在肝硬化中，門脈周圍區(qū)域的肝臟祖細(xì)胞HPCS及小管樣反應(yīng)細(xì)胞主要為OV6CK19CK7HEPATOCYTE，少數(shù)為OV6。隨著門脈及實(shí)質(zhì)內(nèi)炎癥的加重，HPCS及小管樣反應(yīng)從肝硬化結(jié)節(jié)周圍向肝實(shí)質(zhì)擴(kuò)散并出現(xiàn)中間型肝細(xì)胞增殖。HPCS及小管樣反應(yīng)細(xì)胞主要為OV6CK19CK7HEPATOCYTE或；中間型肝細(xì)胞為OV6CK19CK7HEPATOCYTE少數(shù)HEPATOCYTE。門脈周圍區(qū)域和纖維間隔內(nèi)存在少量的CKIT細(xì)胞，個別陽性細(xì)胞整合到成熟膽管，其余CKIT細(xì)胞不共表達(dá)OV6、CK7及CK19。結(jié)論人肝硬化存在肝臟祖細(xì)胞的激活；肝臟祖細(xì)胞群的免疫表型差異表明祖細(xì)胞處于不同的分化增殖階段；不同肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物的聯(lián)合運(yùn)用是鑒別和研究肝臟祖細(xì)胞的有力工具。第一部分三、目的研究肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物CKIT、CK7在肝細(xì)胞肝癌HCC組織中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系。方法對40例肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本及3例正常組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察以及CKIT、CK7、CD45免疫組化染色，對腫瘤細(xì)胞的分化程度進(jìn)行分型，分析CKIT、CK7表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌的臨床病理特征的聯(lián)系。結(jié)果正常肝臟中CKIT染色陰性。1940例HCC組織中存在CKIT腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞之間或腫瘤結(jié)節(jié)周圍分散分布。30例75％存在CK7陽性癌細(xì)胞，陽性程度強(qiáng)弱不一，主要存在兩種不同免疫反應(yīng)形態(tài)特征。HBSAG及ANTIHBC在CKIT及CK7HCC表達(dá)更常見P結(jié)論骨髓來源的肝臟祖細(xì)胞參與了HCC的形成和發(fā)展，CKIT、CK7對于判斷HCC預(yù)后有一定意義。第二部分目的闡明在卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生中肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胞外基質(zhì)成分與卵圓細(xì)胞的相互作用，分析肝臟微環(huán)境對卵圓細(xì)胞的調(diào)控作用。方法采用免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)的方法動態(tài)觀察在2AAFPH大鼠卵圓細(xì)胞增殖模型中，隨著卵圓細(xì)胞的增殖和分化，KUPFFER細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肝臟胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白和纖維連接蛋白的定位及與卵圓細(xì)胞的相互關(guān)系。結(jié)果PH后第2天，小卵圓細(xì)胞開始向門靜脈周圍區(qū)域增殖。DESMIN的HSCS及LAMININ主要出現(xiàn)在門靜脈周圍的肝竇狀隙內(nèi)，而KUPFFER細(xì)胞和FIBRONECTIN在整個肝小葉內(nèi)表達(dá)顯著增加。從術(shù)后第4到第9天，卵圓細(xì)胞進(jìn)一步向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)增殖，與HSCS、LAMININ及FIBRONECTIN關(guān)系密切，KUPFFER細(xì)胞與卵圓細(xì)胞混合在一起增殖，第6天以后開始減少。從術(shù)后第12到第15天，隨著卵圓細(xì)胞分化為小肝細(xì)胞節(jié)結(jié)，大多數(shù)HSCS、LAMININ及FIBRONECTIN位于節(jié)結(jié)周邊，少數(shù)出現(xiàn)在節(jié)結(jié)內(nèi)，KUPFFER細(xì)胞主要出現(xiàn)在中央靜脈周圍區(qū)域。第18天以后，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)開始恢復(fù)。結(jié)論在肝損傷后的重建修復(fù)過程中，卵圓細(xì)胞與肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胞外基質(zhì)成分存在緊密的聯(lián)系，局部肝臟微環(huán)境可能通過細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用在卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。第三部分目的建立大鼠卵圓細(xì)胞增殖模型，探討其分離、鑒定、培養(yǎng)的方法；檢測卵圓細(xì)胞端粒酶活性及相關(guān)基因表達(dá)，探討與其增殖分化之間的關(guān)系。方法采用2AAFPH模型誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞增殖，2AAF劑量為15MGKG，于術(shù)后912天采用改良的膠原酶灌注消化密度梯度離心法分離卵圓細(xì)胞，用電鏡、RTPCR、細(xì)胞免疫熒光鑒定卵圓細(xì)胞，采用免疫組化、RTPCR及端粒酶活性檢測試劑盒檢測分離的卵圓細(xì)胞及卵圓細(xì)胞系LE6端粒酶的表達(dá)，并分析其意義。結(jié)果采用2AAFPH模型成功誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞增殖。分離的卵圓細(xì)胞核大，卵圓形，胞漿少，呈鋪路石樣生長，細(xì)胞直徑約7～12ΜM，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有少量絨毛樣突起，核漿比例大，胞漿內(nèi)細(xì)胞器少且發(fā)育不成熟。細(xì)胞免疫熒光、RTPCR結(jié)果顯示表達(dá)0V6、AFP、CK19、ALBUMIN、CKIT、CK18、THY1。免疫組織化學(xué)顯示端粒酶催化亞單位TERT表達(dá)在門靜脈周圍增殖的卵圓細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，隨著卵圓細(xì)胞逐漸向肝細(xì)胞方向分化，TERT陽性細(xì)胞數(shù)目顯著較少。分離的卵圓細(xì)胞及卵圓細(xì)胞系均表達(dá)端粒酶亞單位TERT及TR，與LE6相比，剛分離的卵圓細(xì)胞表達(dá)水平更低；隨著LE6傳代次數(shù)的增加，端粒酶活性逐漸降低。結(jié)論采用劑量為15MGKG的2AAFPH模型可誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞大量增殖；改良的膠原酶灌注消化、密度梯度離心的分離方法可獲取純度較高的卵圓細(xì)胞；端粒酶活性可能是卵圓細(xì)胞維持其增殖能力和多分化潛能的一個必要條件。

簡介：研究背景血管長期暴露于搏動性血流的作用下，后者產(chǎn)生的機(jī)械生物力對于正常的血管結(jié)構(gòu)和功能的維持具有關(guān)鍵作用。血管中的搏動性血流主要產(chǎn)生兩種形式的機(jī)械生物力，分別是平行于血管長軸的剪切力SHEARSTRESS和垂直于血管長軸的機(jī)械牽張力STRETCHSTRESS。內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管最里面，直接與血流接觸，因此剪切力主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。而牽張力主要是由于心臟周期性搏動引起的血管擴(kuò)張產(chǎn)生的，因此作用于血管各層細(xì)胞，但血管平滑肌細(xì)胞VSMCS是其主要的靶細(xì)胞。大量的體內(nèi)外研究證實(shí)，機(jī)械牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移以及表型等生物學(xué)功能。一般認(rèn)為，在正常情況下牽張力9％～12％ELONGATION抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡等功能，對于維持血管平衡具有重要調(diào)節(jié)作用，而在高血壓、動脈粥樣硬化等病理情況下，異常增高的牽張力＞15％ELONGATION則促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等功能，誘導(dǎo)正常的血管結(jié)構(gòu)改變和功能失調(diào)。近年來國內(nèi)外學(xué)者對機(jī)械牽張力調(diào)控平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的分子機(jī)制做了深入研究，認(rèn)為細(xì)胞表面具有力學(xué)信號感受作用的各種分子可以將胞外的機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的化學(xué)信號，通過激活一系列的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)功能改變。但是目前對這一機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的諸多機(jī)制尚不清楚，比如細(xì)胞表面是否存在特異性的力學(xué)信號感受分子，細(xì)胞內(nèi)各信號分子之間的相互作用模式，以及在轉(zhuǎn)錄水平之外的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制等。進(jìn)一步深入了解牽張力調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的分子機(jī)制，對于尋找新的高血壓、冠心病等心血管疾病干預(yù)靶點(diǎn)具有重要的意義。MICRNASMIRNAS是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，通過抑制靶基因的翻譯或促進(jìn)MRNA的降解在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。研究證實(shí)，MIRNAS在心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育以及多種病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MIRNAS也參與機(jī)械生物力調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，與靜止培養(yǎng)相比，剪切力誘導(dǎo)多個內(nèi)皮細(xì)胞MIRNAS表達(dá)改變，其中MIR19A與MIR23B在剪切力調(diào)控細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用，MIR92A介導(dǎo)剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞NO的水平的調(diào)控。但是關(guān)于牽張力對血管細(xì)胞MIRNAS表達(dá)的影響，以及后者在牽張力介導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用目前還不清楚。MIR21是近年廣泛研究的一種MIRNA，其在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡作用。此外，MIR21在血管細(xì)胞中也有豐富表達(dá)，并且在損傷血管中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成。新近的研究發(fā)現(xiàn)，MIR21在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)受到剪切力的調(diào)節(jié)，并且不同形式的剪切力對MIR21表達(dá)的影響是不同的，MIR21分別在剪切力介導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥、NO生成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。MIR21在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)豐度明顯高于內(nèi)皮細(xì)胞中，鑒于MIR21在細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)節(jié)中的作用以及機(jī)械牽張力對平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們推測牽張力可能通過調(diào)節(jié)MIR21在血管平滑肌細(xì)胞中的水平影響細(xì)胞功能。目前對MIRNAS的研究多集中在其生物學(xué)效應(yīng)方面，而對MIRNAS本身的表達(dá)調(diào)控機(jī)制知之甚少，MIR21基因位于蛋白編碼基因之間，具有獨(dú)立的啟動子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)AP1，NFΚB等轉(zhuǎn)錄因子可能參與MIR21表達(dá)調(diào)控，但是在牽張力的作用下，參與調(diào)節(jié)MIR21表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子尚不明確。深入了解MIRNAS的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有利于系統(tǒng)的認(rèn)識牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能的分子機(jī)制，因此，在本研究中我們也初步探討牽張力調(diào)節(jié)MIR21表達(dá)的上游分子機(jī)制。研究目的1在體外細(xì)胞水平，明確牽張力對血管平滑肌細(xì)胞MIR21表達(dá)的影響。2明確MIR21在牽張力介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用。3明確牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞MIR21表達(dá)的分子機(jī)制。研究方法1人主動脈平滑肌細(xì)胞HASMCS培養(yǎng)HASMCS細(xì)胞株購自美國SCIENCELL公司，細(xì)胞生長至完全融合后，吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞一遍以去除殘留的血清，然后加入適量預(yù)熱的025％胰蛋白酶，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞細(xì)胞變圓后，吸去胰酶，加入新的平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基吹打均勻，轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入含5％CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2機(jī)械牽張力干預(yù)體外培養(yǎng)的HASMCS接種HASMCS至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的FLEXCELL6孔板中105細(xì)胞孔，待細(xì)胞生長至80％～90％融合時，利用無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后，更換新的完全培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基，使用FLEXCELL5000細(xì)胞牽張力儀給予HASMCS不同強(qiáng)度的牽張力刺激，分組如下110％牽張力組分別給予最大牽拉強(qiáng)度為10％，頻率為1HZ的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞0、3、6、12、24小時。216％牽張力組分別給予最大牽拉強(qiáng)度為16％，頻率為1HZ的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞0、3、6、12、24小時。3實(shí)時熒光定量PCR檢測MIR21表達(dá)水平使用INVITROGEN公司的TRIZOL提取包含MIRNAS的HASMCS總RNA，利用丹麥EXIQON公司的MIRNDNA合成試劑盒和MIRNASSYRBGREENMASTERMIX試劑盒分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，小RNAU6作為各樣本MIR21表達(dá)水平的內(nèi)參照，每組樣本重復(fù)檢測4次。U6及MIR21PCR引物均購自EXIQON公司。4細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用INVITROGEN公司的LIPOFECTAMINE2000分別轉(zhuǎn)染不同濃度的MIR21INHIBIT和MIMICS，調(diào)節(jié)HASMCSMIR21的表達(dá)水平，化學(xué)修飾的MIR21INHIBIT和MIMICS均由上海吉瑪公司合成，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)HASMCSPDCD4蛋白水平。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時后，給予細(xì)胞牽張力刺激，觀察相應(yīng)的細(xì)胞功能或目的蛋白水平變化。5HASMCS增殖檢測牽張力干預(yù)體外培養(yǎng)的HASMCS12小時，利用美國羅氏公司的BRDU細(xì)胞增殖檢測試劑盒或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測牽張力對HASMCS增殖的影響轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT或MIMICS48小時后，再給予牽張力干預(yù)12小時后，BRDU摻入法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測HASMCS增殖水平，明確MIR21在牽張力介導(dǎo)的HASMCS增殖中的作用。6WESTERNBLOT牽張力刺激HASMCS結(jié)束后，提取胞漿蛋白，測定蛋白濃度后加蛋白上樣緩沖液煮沸5分鐘。取15～20UG蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，利用WESTERNBLOT分別檢測P27，PRB，以及PDCD4蛋白表達(dá)。每個樣本重復(fù)檢測4次，ΒACTIN作為內(nèi)參。7細(xì)胞凋亡檢測利用BIPEC公司的ANNEXINVFITCAPOPTOSISDETECTIONKIT檢測HASMCS凋亡情況。牽張力干預(yù)結(jié)束后，用胰酶消化的方法收集細(xì)胞，每個樣本用400ULBINDINGBUFFER重懸，經(jīng)過15分鐘的ANNEXINVFITC標(biāo)記，5分鐘PI標(biāo)記后，在1小時內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞流式分析，每個樣本在流式分析中計(jì)數(shù)10000個細(xì)胞。8實(shí)時熒光定量PCR測定PRIMIR21、PREMIR21、PDCD4MRNA水平牽張力刺激HASMCS結(jié)束后，利用TRIZOL提取細(xì)胞總RNA。使用日本TAKARA公司的CDNA合成試劑盒將樣本總RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，然后利用TAKARA公司的SYBRGREEN實(shí)時定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物由上海吉瑪公司合成。PCR反應(yīng)結(jié)束后得到CT值，并計(jì)算2△△CT，ΒACTIN作為PRIMIR21、PREMIR21、PDCD4MRNA表達(dá)水平的內(nèi)參。9細(xì)胞免疫熒光16％牽張力刺激體外培養(yǎng)的HASMCS3小時后，利用免疫熒光方法觀察CFOS、CJUN的表達(dá)變化。牽張力刺激細(xì)胞結(jié)束后，免疫染色固定液固定30分鐘，PBS沖洗后加01％TRITONX100室溫下孵育8分鐘，繼之用5％BSA封閉30分鐘，經(jīng)PBS沖洗后4℃條件下分別孵育CFOS，CJUN抗體CELLSIGNALINGTECHNOLOGY1∶200過夜，次日，經(jīng)過熒光二抗孵育1小時，DAPI染核后，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察目的蛋白的表達(dá)水平。10凝膠遷移實(shí)驗(yàn)EMSA利用EMSA方法檢測16％牽張力對轉(zhuǎn)錄因子AP1與NFΚB活性的影響。牽張力干預(yù)平滑肌細(xì)胞結(jié)束后，利用PIERCE細(xì)胞核蛋白提取試劑盒收集細(xì)胞核蛋白，并利用BCA方法檢測核蛋白的濃度。使用T4連接酶在AP1與NFΚB雙鏈核苷酸探針末端標(biāo)記Γ32PATP，取8UG核蛋白與標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子探針及試劑盒其它成分共計(jì)20UL預(yù)混后，冰上孵育30分鐘，然后用4％非變性膠進(jìn)行電泳，根據(jù)PIERCEEMSA試劑盒說明書操作具體步驟。11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用SPSS130統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組之間的比較采用非配對T檢驗(yàn)，多組之間的比較采單因素方差分析，P＜005認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1機(jī)械牽張力對體外培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細(xì)胞HASMCSMIR21表達(dá)水平的影響研究結(jié)果顯示，在無血清條件下，與靜止培養(yǎng)的細(xì)胞相比，16％牽張力自6小時開始顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的HASMCSMIR21的表達(dá)水平，上調(diào)趨勢保持到24小時，表達(dá)高峰在12小時P＜001）而10％牽張力對HASMCSMIR21的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響P＞005）。在有血清刺激的條件下，16％牽張力仍然持續(xù)上調(diào)MIR21的表達(dá)P＜001，但上調(diào)幅度沒有無血清條件下明顯而10％牽張力明顯抑制MIR21的表達(dá)，與靜止對照相比，MIR21的表達(dá)6小時開始顯著下調(diào)P＜005，12小時下調(diào)最明顯。2MIR21在機(jī)械牽張力調(diào)控人主動脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用利用BRDU摻入法與細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測MIR21在牽張力調(diào)節(jié)的HASMCS增殖中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的細(xì)胞相比16％牽張力顯著增強(qiáng)HASMCS的增殖水平轉(zhuǎn)染MIR21抑制物INHIBIT抑制MIR21的水平，結(jié)果與MIRNA陰性對照INHIBIT相比，MIR21的表達(dá)水平下調(diào)42倍P＜001，而轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT的HASMCS增殖水平顯著下降P＜001。同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，利用胰酶消化的方法收集細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示與BRDU摻入法一致P＜005。由于在含血清條件下，10％牽張力抑制MIR21的表達(dá)，轉(zhuǎn)染化學(xué)修飾的MIR21類似物MIMICS上調(diào)MIR21的表達(dá)水平，結(jié)果顯示MIR21MIMICS升高M(jìn)IR21的表達(dá)70倍P＜001）而BRDU摻入法結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的HASMCS相比，10％牽張力顯著抑制細(xì)胞的增殖水平P＜001，而轉(zhuǎn)染MIR21MIMICS顯著降低10％牽張力對HASMCS增殖的抑制作用P＜005。WESTERNBLOT結(jié)果顯示16％牽張力抑制細(xì)胞周期抑制因子P27的表達(dá)，促進(jìn)PRB的表達(dá)P＜001而與轉(zhuǎn)染MIRNA陰性對照INHIBIT相比，MIR21INHIBIT部分逆轉(zhuǎn)16％牽張力對P27，PRB表達(dá)的影響P＜001）。3MIR21在機(jī)械牽張力介導(dǎo)的人主動脈平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用利用ANNEXINFITC與PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒檢測牽張力對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示與靜止對照組比較，16％牽張力增加體外培養(yǎng)的HASMCS凋亡水平919±066VS133±012，P＜001轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT抑制MIR21的水平，結(jié)果顯示與陰性對照MIRNAINHIBIT相比較，MIR21INHIBIT顯著增強(qiáng)了16％牽張力對HASMCS的促凋亡作用255±161VS938±157，P＜001在靜止培養(yǎng)的HASMCS中，轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT對細(xì)胞凋亡沒有顯著的影響。在有血清條件下，對靜止對照組相比較，10％牽張力對HASMCS的凋亡沒有顯著影響P＞005。4PDCD4在16％牽張力介導(dǎo)的人主動脈平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用利用TAKARACDNA合成與SYBRGREENPCR定量試劑盒檢測16％牽張力對HASMCSPDCDMRNA水平的影響，結(jié)果顯示與靜止對照組相比，16％牽張力增加PDCD的MRNA水平198倍P＜005，而WESTERNBLOT結(jié)果顯示，16％牽張力顯著抑制PDCD的蛋白水平055倍P＜005）。轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT后，16％牽張力對HASMCSPDCD4蛋白水平的抑制作用明顯減輕P＜005。為明確PDCD4在牽張力誘導(dǎo)的HASMCS凋亡中的作用，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)其蛋白表達(dá)水平，再給予16％牽張力刺激，細(xì)胞流式結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒明顯促進(jìn)16％牽張力的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用P＜001）。516％牽張力對人主動脈平滑肌細(xì)胞AP1、NFΚB活性的影響利用實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測16％牽張力對HASMCSMIR21轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物PRIMIR21，前體PREMIR21水平的影響，結(jié)果顯示對靜止對照相比，16％牽張力分別增加PRIMIR21水平173倍P＜005，PREMIR21水平285倍P＜001。AP1、NFΚB是介導(dǎo)機(jī)械牽張力調(diào)控平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，在特定條件下也參與MIR21的表達(dá)調(diào)控。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，16％牽張力明顯增加NFΚBP65的磷酸化水平，高峰在牽張力干預(yù)后1、3小時，至6小時恢復(fù)至靜止對照水平，而16％牽張力對NFΚBP65的蛋白水平?jīng)]有顯著影響16％牽張力持續(xù)引起CJUN的表達(dá)水平和磷酸化水平顯著增高，但對CFOS蛋白的表達(dá)水平及磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，16％牽張力增加CJUN在細(xì)胞核中的表達(dá)，而增加CFOS在胞漿中的表達(dá)，CFOS在胞核中的表達(dá)沒有顯著變化。EMSA結(jié)果顯示，16％牽張力顯著增加HASMCSAP1與NFΚB的活性P＜005。6AP1、NFΚB在16％牽張力誘導(dǎo)HASMCSMIR21表達(dá)中的作用利用LIPO2000轉(zhuǎn)染CJUNSIRNA下調(diào)HASMCSCJUN的表達(dá)，16％牽張力干預(yù)HASMCS前1小時，加入NFΚB抑制劑SN50抑制其活性P＜001。結(jié)果顯示，CJUNSIRNA明顯抑制HASMCS中CJUN的表達(dá)，16％牽張力誘導(dǎo)的AP1活性顯著下降P＜001。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，CJUNSIRNA抑制16％牽張力誘導(dǎo)的MIR21表達(dá)P＜001，而SN50對16％牽張力誘導(dǎo)的MIR21表達(dá)沒有明顯作用P＞005。結(jié)論116％機(jī)械牽張力上調(diào)人主動脈平滑肌細(xì)胞MIR21的表達(dá)，而在有血清條件下，10％牽張力抑制MIR21的表達(dá)水平。2MIR21參與介導(dǎo)機(jī)械牽張力調(diào)節(jié)人主動脈平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的作用。3機(jī)械牽張力通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子AP1CJUN的活性上調(diào)人主動脈平滑肌細(xì)胞MIR21表達(dá)。

簡介：目的研究結(jié)締組織生長因子CONNECTIVETISSUEGROWTHFACTCTGF對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞HYPERTROPHICSCARFIBROBLASTHSF生物學(xué)功能的影響探討CTGF獨(dú)立致組織纖維化的作用機(jī)理并初步確定絲裂原活化蛋白激酶MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEMAPK各亞家族作為其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化效應(yīng)為增生性瘢痕發(fā)病機(jī)制研究及防治措施提供新的思路方法1、分離培養(yǎng)人HSF以正常人皮膚成纖維細(xì)胞NMALSKINFIBROBLASTNSF作為對照采用不同濃度CTGF作用細(xì)胞或以同一濃度CTGF作用細(xì)胞不同時間后MTT法檢測細(xì)胞增殖H3脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞膠原合成率RTPCR檢測細(xì)胞Ⅰ型前膠原、CTGFMRNA的表達(dá)。2、應(yīng)用WESTERNBLOT蛋白免疫印跡法檢測CTGF刺激細(xì)胞后不同時相點(diǎn)MAPK途徑亞家族ERK12、P38、JNK磷酸化蛋白表達(dá)的動態(tài)變化情況篩選CTGF作用于HSF活化的下游MAPK信號分子。3、預(yù)先用ERK12特異性抑制劑PD98059及P38特異性抑制劑SB203580阻斷細(xì)胞信號再加入CTGF刺激MTT法及H3胸腺嘧啶摻入法H3TDR檢測細(xì)胞增殖H3脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞膠原合成RTPCR檢測細(xì)胞Ⅰ型前膠原、CTGFMRNA、ΑSMAMRNA的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測ΑSMA陽性細(xì)胞率WESTERNBLOT技術(shù)檢測ΑSMA蛋白表達(dá)變化確定CTGF活化MAPK亞家族P38、ERK12的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響過程。結(jié)果1、MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSF在CTGF的獨(dú)立刺激作用下增殖明顯在一定濃度范圍5NGML～20NGML及時間0～48H呈明顯的濃度依賴性和時間依賴性CTGF對HSF的促增殖作用強(qiáng)于NSF。2、H3脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞膠原合成變化發(fā)現(xiàn)小劑量CTGF5NGML即能顯著增加HSF的膠原合成且隨CTGF濃度的升高及作用時間的延長而增強(qiáng)CTGF也能增加NSF膠原合成水平但增加幅度較低。RTPCR法檢測HSF與NSF細(xì)胞Ⅰ型前膠原MRNA表達(dá)變化趨勢的結(jié)果類似。3、RTPCR法檢測在外源性CTGF刺激下HSF細(xì)胞內(nèi)CTGFMRNA的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)在50NGMLCTGF的刺激作用下HSF中CTGFMRNA于刺激開始后8H表達(dá)顯著升高且一直保持升高趨勢于48H后表達(dá)水平達(dá)到峰值并至少維持至72H與空白對照組比有顯著性差異P＜005NSF中CTGFMRNA的表達(dá)在外源性CTGF刺激作用下也有小幅度增高。4、WESTERNBLOT法檢測CTGF作用后HSF中MAPK信號的活化情況發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK12的表達(dá)自刺激作用開始后10MIN即顯著升高30MIN時活化達(dá)到最高峰此后逐漸下降240MIN時恢復(fù)至刺激前水平磷酸化P38表達(dá)自CTGF作用后30MIN增高120MIN時達(dá)到最高峰此后逐漸下降240MIN時恢復(fù)至刺激前水平磷酸化JNK表達(dá)水平在CTGF刺激作用下240MIN內(nèi)均無顯著變化。5、采用PD98059特異性阻斷HSF中ERK12信號通路再用CTGF進(jìn)行刺激結(jié)果提示與未用PD98059阻斷組相比細(xì)胞增殖率及DNA合成率均顯著受抑但仍高于無CTGF刺激組P＜005ΑSMA的MRNA及蛋白表達(dá)與ΑSMA陽性細(xì)胞率、膠原合成及CTGFMRNA表達(dá)等在阻斷前后無顯著性變化。6、采用SB203580特異性阻斷HSF中P38信號通路再加入CTGF進(jìn)行刺激結(jié)果顯示ΑSMAMRNA及蛋白表達(dá)、ΑSMA陽性細(xì)胞率等細(xì)胞轉(zhuǎn)分化指標(biāo)與未阻斷組相比顯著受抑但仍高于無CTGF刺激組P＜005細(xì)胞增殖及DNA合成、膠原合成率、Ⅰ型前膠原MRNA、CTGFMRNA的表達(dá)均未受到抑制。結(jié)論1、CTGF能獨(dú)立有效地促進(jìn)HSF增殖、轉(zhuǎn)分化及膠原合成其促增殖作用具有顯著的濃度依賴性和時間依賴性。2、CTGF具有對HSF細(xì)胞促進(jìn)自身CTGFMRNA自分泌表達(dá)的效應(yīng)。3、CTGF主要通過激活MAPK通路中ERK12及P38亞家族信號途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)其中對ERK12信號途徑的活化部分介導(dǎo)CTGF刺激HSF細(xì)胞增殖效應(yīng)對P38信號途徑的活化部分介導(dǎo)CTGF誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效應(yīng)。

簡介：分類號分類號R7337學(xué)校代號學(xué)校代號10392學(xué)科專業(yè)代碼學(xué)科專業(yè)代碼100208學(xué)號號200901517福建醫(yī)科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文慢病毒介導(dǎo)慢病毒介導(dǎo)WWOX基因過表達(dá)基因過表達(dá)對JURKAT及K562白血病細(xì)胞白血病細(xì)胞生物學(xué)特性影響生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究的實(shí)驗(yàn)研究EFFECTSOFLENTIVIRUSMEDIATEDWWOXGENEOVEREXPRESSIONONBIOLOGICALPROPERTIESOFJURKATK562HUMANHEMATOPOIETICMALIGNANTCELLS學(xué)位類型型醫(yī)學(xué)碩士醫(yī)學(xué)碩士所在學(xué)院院醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院研究生崔兆磊崔兆磊學(xué)科、?？?、專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)導(dǎo)師林東紅林東紅教授教授胡建達(dá)胡建達(dá)教授教授研究起止日期研究起止日期2010年9月至月至2012年2月答辯日期2012年5月31日二〇一二年二〇一二年六月目錄中文摘要1英文摘要3前言6第一部分WWOX基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定8材料與方法8實(shí)驗(yàn)結(jié)果16討論21結(jié)論22第二部分慢病毒介導(dǎo)的WWOX過表達(dá)對JURKAT及K562白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響23材料與方法23實(shí)驗(yàn)結(jié)果29討論43結(jié)論46第三部分WWOX基因過表達(dá)誘導(dǎo)JURKAT及K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究47材料與方法47實(shí)驗(yàn)結(jié)果53討論60結(jié)論63參考文獻(xiàn)64綜述69致謝78