簡介：點(diǎn)擊查看更多成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)WnT-3a后的生物學(xué)特性分析和Wnt信號通路的基因芯片分析.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文臍帶血干祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增及擴(kuò)增后干祖細(xì)胞生物學(xué)特性的研究姓名翟瓊莉申請學(xué)位級別博士專業(yè)病理與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師韓忠朝邱錄貴200251薛士筍往矗立1苷要粒酶催化亞單位一一HTERTMRNA水平表達(dá)的變化，進(jìn)一步評價(jià)了擴(kuò)增后UCBHSPC的增殖和自我更新能力。／結(jié)果1本研究的培養(yǎng)體系可有效支持UCBACL33‘細(xì)胞的擴(kuò)增。經(jīng)過兩周的培養(yǎng)，從較早期的ACL33CD34、ACL33CD34、HPPCFU、CFUGEMM、ACL33及CD34細(xì)胞群，到各系定向祖細(xì)胞CFUGM和BFUE均得到持續(xù)顯著的擴(kuò)增；2在體外擴(kuò)增中，發(fā)現(xiàn)ACI33抗原的消失早于CD34，從ACI33／CD34細(xì)胞亞群變化推測細(xì)胞的分化過程可能是由ACL33CD34一ACL33CD34一ACT33CD34一HCL33一CD34。這一動(dòng)態(tài)增殖過程提示ACL33是比CD34更為早期的HSPC表面標(biāo)志；3擴(kuò)增后CD34細(xì)胞與原代CD34細(xì)胞的端粒酶活性相當(dāng)或有所升高，提示本研究建立的體外培養(yǎng)體系可保持?jǐn)U增后HSPC的增殖和自我更新潛能。擴(kuò)增后HSPC在移植受體內(nèi)重建持久造血的潛能除與其增殖分化及自我更新潛能密切相關(guān)，還須具有完整的歸巢功能。由于缺乏合適的方法檢測人HSC的體內(nèi)造血潛能，體外擴(kuò)增后HSPC的功能特性至今仍未完全明了。歸巢過程包括粘附和遷移，原代HSPC粘附和趨化方面的研究已有很多報(bào)道，但有關(guān)體外擴(kuò)增對HSPC歸巢相關(guān)功能影響的體外研究還很少，對擴(kuò)增后HSPC粘附和遷移功能的系統(tǒng)研究無疑將為進(jìn)一步優(yōu)化UCBHSPC的體外擴(kuò)增體系和擴(kuò)增后基于該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)將CD34細(xì)胞從擴(kuò)增產(chǎn)物中再次純化出來，從動(dòng)態(tài)的角度觀察了擴(kuò)增過程中UCBCD34細(xì)胞歸巢相關(guān)細(xì)胞粘附分子CAMS的表達(dá)、粘附功能、趨化功能和趨化因子受體CXCR4表達(dá)的變化，從而評價(jià)細(xì)胞因子介導(dǎo)的簽叢芷燮對UCBHSPC體外歸巢相關(guān)功能的影響。這也是本研究的創(chuàng)新之處和重點(diǎn)所在結(jié)果1幾種與歸巢密切相關(guān)的粘附分子如CD49D、CD49E、CDLLA和CD44在擴(kuò)增后CD34細(xì)胞表面的表達(dá)水平與擴(kuò)增前持平或有所上升，這對保持?jǐn)U增后HSPC在移植受體內(nèi)的植活潛能具有特別重要的意義；2擴(kuò)增培養(yǎng)的前10天，CD34細(xì)胞的SDF1誘導(dǎo)粘附率和自發(fā)粘附率均呈明顯上升趨勢，至14天時(shí)恢復(fù)至原有水平或略有降低，表明擴(kuò)增后CD34

簡介：南華大學(xué)碩士學(xué)位論文CAVEOLIN1在胃癌組織中的表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響姓名羅紅梅申請學(xué)位級別碩士專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師唐圣松張蒙夏20040301羅紅梅南華大學(xué)同等學(xué)歷人員碩士學(xué)位論文CAVEOLIN一1在胃癌組織中的表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響研究生羅紅梅導(dǎo)師唐圣松教授張蒙夏副教授摘要研究背景CAVEOLIN．1是CAVEOLAE膜結(jié)構(gòu)的重要結(jié)構(gòu)蛋白，與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞飲液作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)。CAVEOLIN1可通過其骨架區(qū)域抑制SRC家族酪氨酸激酶、EGFR、NEU及PKC等多種蛋白激酶的活性，CAVEOLIN．1也能抑制ERK的活性。由于這些信號分子是引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要因子，禹此CAVEOLIN1可能具有抑制轉(zhuǎn)化的活性。在脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等終末分化的細(xì)胞中，CAVEOLIN．1表達(dá)甚高，但在癌基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、惡性腫瘤組織中不表達(dá)或表達(dá)甚低。研究證實(shí)編碼人CAVEOLIN1的基因位于一高度疑似腫瘤抑制基因位點(diǎn)7Q31．1，此位點(diǎn)在肝癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮肌瘤、胃癌等多種腫瘤中缺失或斷裂。因此，推測CAVEOLIN．1可能是一候選抑癌基因。但上調(diào)EAVEOLIN1的表達(dá)是否能延緩癌細(xì)胞的增殖周期或促進(jìn)癌細(xì)胞的分化至今仍不甚明了。尤其是CAVEOLIN1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制不清。方法用免疫組織化學(xué)SABC法檢測43例胃癌存檔蠟塊組織及15例胃炎活檢標(biāo)本及WESTERNBLOT對2例合法引產(chǎn)的胚胎胃、5例胃癌及其癌旁組織EAVEOLIN1蛋白的表達(dá)。用LIPOFECTIN將EAVEOLIN．1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系建立穩(wěn)定表達(dá)CAVEOLIN．1的胃癌細(xì)胞系MGC903／CAV．1，并將空載體轉(zhuǎn)染MGCS03作為對照MGC803／PCINEO。采用免疫細(xì)胞化學(xué)及WESTEMBLOT檢測轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的MGC803細(xì)胞中CAVEOLIN。L的表達(dá)情況。運(yùn)用顯微鏡觀察EAVEOLIN1對MCRCS03細(xì)胞分化的影響；應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等檢測CAVEOLIN．1對MGC903細(xì)胞存活率及增殖周期的影響，WESTERNBLOT檢測CAVEOLIN1對MGC803細(xì)胞中CYCLIND1及ERKL／2活性的影響。結(jié)果結(jié)果顯示EAVEOLINL在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于正常胃組織，其表達(dá)水平與胃癌的分化程度、癌細(xì)胞浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)分化程度越高，CAVEOLIN一1表達(dá)越高，反之。則越低；浸潤越深表達(dá)越低；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其表達(dá)明顯低于無轉(zhuǎn)

簡介：第一部分穿孔素和顆粒酶B與肝移植生物學(xué)排異的相關(guān)性研究研究穿孔素和顆粒酶B在肝移植生物學(xué)排異中的診斷意義結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝移植急性生物學(xué)排異時(shí)穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)明顯增多顆粒酶B與穿孔素對肝移植急性生物學(xué)排異的診斷準(zhǔn)確率分別為9268％和8537％第二部分細(xì)胞因子基因多態(tài)性與肝移植急性生物學(xué)排異關(guān)系的研究第一節(jié)正常漢族人群細(xì)胞因子基因多態(tài)性分析提示中國不同的漢族正常人群細(xì)胞因子基因多態(tài)性分布可能不同第二節(jié)受體細(xì)胞因子基因多態(tài)性與肝移植急性生物學(xué)排異關(guān)系提示受體TNFΑ高表達(dá)受體IL10低表達(dá)、受體TNFΑ高表達(dá)受體TGFΒ1高表達(dá)可能是急性生物學(xué)排異反應(yīng)的危險(xiǎn)因素第三節(jié)供體細(xì)胞因子基因多態(tài)性與肝移植急性生物學(xué)排異關(guān)系研究供體腫瘤壞死因子ΑTNFΑ、白介素10IL10、白細(xì)胞介素6IL6、轉(zhuǎn)化生長因子Β1TGFΒ1和干擾素ΓIFNΓ的基因調(diào)節(jié)區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性分布與肝移植急性生物學(xué)排異的關(guān)系提示供體細(xì)胞因子TGFΒ1高表達(dá)基因型可能對肝移植急性生物學(xué)排異有保護(hù)作用第四節(jié)供受體細(xì)胞因子配對與肝移植急性生物學(xué)排異關(guān)系應(yīng)用上述方法研究供受體細(xì)胞因子配對與肝移植急性生物學(xué)排異關(guān)系結(jié)果顯示排異組中受體TGFΒ1高表達(dá)供體TGFΒ1低表達(dá)組合對其他表達(dá)形式的比例顯著高于非排異組說明受體TGFΒ1高表達(dá)供體TGFΒ1低表達(dá)可能為急性生物學(xué)排異反應(yīng)的危險(xiǎn)因素

簡介：第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男ｏL(fēng)和科研作風(fēng)，本人申明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我校或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名華址日期I廠IC第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解第三軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬第三軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為第三軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文下15PPRNARNASIN甲MRTPCR碘化丙咬磷脂酸絲氨酸核糖核酸核糖核酸酶抑制劑每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SABCSDSPAGESPFTBEPROPIDIUMIODIDEPHOSPHATIDYLSERINERIBONUCLEASEACIDRIBONUCLEASEINHIBATORROUNDPER而NUTEREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTIONSTREPTAVIDINBIOTINCOMPLEXSODIUMDODECYLSULFATEPOLYACRYAMIDEGELELECTROPHORESISSPECIFICPATHOGENFREETRISBORONATEEDTABUFFERTEMEDTRISTSGTUNELTETRAMETHYLETHYLENEDIAMINETRIHYDROXYMETHYLAMINOMETHANETUMORSUPPRESSORGENETERMINALDEOXYNUCLNEOTIDYTRANSFERASEMEDIATEDUTPNICKENDLABELLING△NP73WILDTYPENHTERMINALTRANSACTIVATIONDOMAINTRUNCATEDP73鏈霉生物素一親合素復(fù)合物十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺凝膠電泳無特殊病原體TRIS硼酸乙二胺四乙酸緩沖液四甲基乙二胺三輕甲基氨基甲烷抑癌基因末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶TDT介導(dǎo)的DUT缺口末端標(biāo)記技術(shù)野生型P73基因N末端轉(zhuǎn)錄活化區(qū)丟失的異構(gòu)體

簡介：犬同等學(xué)力申請碩士學(xué)位論文2005屆硫氧還蛋白反義寡核菩酸對前列腺癌PC3細(xì)胞生物學(xué)特性的影響EFFECTSOFTHIOREDOXINASONTOBIOLOGICALCHARACTERISTCSOFPROSTATECANCERPC3CELLS研究生姓名一玉』整盎一一指導(dǎo)教師姓名一一JL至、主一々業(yè)名稱皇墨生研究方向直到墮垂IJ盎熊塹童論文提交日期2業(yè)5生璺旦一一硫氧還蛋白反義寡核苷酸對前列腺癌PC3細(xì)胞生物學(xué)特性的影響中文摘要結(jié)論應(yīng)用反義寡核苷酸封閉TRX基因表達(dá)能抑制前列腺癌細(xì)胞體外生長活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有望成為前列腺癌基因治療的有效策略。關(guān)鍵詞前列腺腫瘤癌；硫氧還蛋白；反義寡核苷酸I【作者王曉春指導(dǎo)老師單玉喜

簡介：點(diǎn)擊查看更多CD34+細(xì)胞生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：分類號R7352密級公開UDC610編號201209003攻讀碩士學(xué)位研究生畢業(yè)論文體外體外RNARNA干擾抑制干擾抑制REG4REG4基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響生物學(xué)行為的影響論文起止時(shí)間20101020123指導(dǎo)教師耿排力教授呂有勇教授永勝副教授陸東明教授劉彥平教授學(xué)生姓名胥瑾論文類型理論研究學(xué)科專業(yè)名稱免疫學(xué)研究方向腫瘤免疫腫瘤免疫學(xué)院系、部醫(yī)學(xué)院青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院2009級攻讀碩士學(xué)位研究生畢業(yè)論文第2頁共40頁英文縮略語表英文縮略語表縮略詞英文名稱中文名稱APAMMONIUMPERSULFATE過硫酸銨AMPAMPICILLIN氨芐青霉素BPBASEPAIR堿基對BSABOVINESERUMALBUMIN牛血清白蛋白BLASTBASICLOCALALIGNMENTSEARCHTOOL同源性比較搜索工具CLCONFIDENCEINTERVAL可信區(qū)間CDNACOMLEMENTARYDNA互補(bǔ)脫氧核糖核酸DEPCDIETHYLPYROCABONATE焦碳酸二乙脂DMSODIMETHYLSULFOXIDE二甲基亞砜DDTDITHIOTHRETUL二硫蘇糖醇DNTPDEOXYRIBONUCLEASE脫氧核苷三磷酸EBETHIDIUMBROE溴化乙錠ECLENCHANTEDCHEMILUMINESCENCE增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光EDTAETHYLENEDIAMINETETRAACETICACID乙二酰四乙酸FBSFETALBOVINESERUM胎牛血清KDKILODALTON千道爾頓LBLURIABETANIMEDIUMLB培養(yǎng)基MINMINUTE（S）分鐘MRNAMESSENGERRNA信使核糖核酸MTTMETHYLTHIAZOLYLTETRAZOLIUM噻唑藍(lán)ODOPTICALDESITY光密度PAGEPOLYACRYLAEGELELECTROPHESIS聚丙烯酰胺凝膠電泳RMPREVOLUTIONSPERMINUTE每分鐘轉(zhuǎn)速SDSSODIUMDODECYLSULFATE十二烷基磺酸鈉RTPCRREVERSETRANIONPCR逆轉(zhuǎn)錄PCR

簡介：本實(shí)驗(yàn)研究了丙型肝炎病毒HCV持續(xù)感染對體外培養(yǎng)人合體滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響及其機(jī)理。主要內(nèi)容如下一、HCV持續(xù)感染對體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。人晚期囊胚著床后，滋養(yǎng)層內(nèi)層分裂生長的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞迅速分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞對受精卵的著床以及母體胎兒交互式血液循環(huán)的建立均有重要意義，其可侵入母體子宮蛻膜及子宮螺旋動(dòng)脈，是胎盤形成的主要功能細(xì)胞。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞是人體正常細(xì)胞中唯一具有侵襲能力的細(xì)胞，類似于腫瘤細(xì)胞。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞也具有活躍的合成物質(zhì)的能力，其合成分泌的人絨毛膜促性腺激素HCG、人胎盤生乳素HPL等對妊娠的維持以及胎兒的發(fā)育均有十分重要的意義。因此，本實(shí)驗(yàn)分別采用MATRIGEL人工重建基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)來研究HCV感染對體外培養(yǎng)人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的影響，并研究細(xì)胞感染HCV后粘附、移動(dòng)能力以及激素合成分泌能力以HCG為檢測因子的改變。研究證實(shí)HCV持續(xù)感染可抑制體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞包括侵襲能力和激素合成分泌能力在內(nèi)的多種生物學(xué)功能。二、HCV持續(xù)感染對體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP2和MMP9合成分泌的影響。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力是其侵入母體子宮蛻膜及子宮螺旋動(dòng)脈，參與形成胎盤胎盤屏障的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究表明，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力與金屬蛋白酶2MATRIXMETALLOPROTEINASE2，MMP2和金屬蛋白酶9MATRIXMETALLOPROTEINASE9，MMP9密切相關(guān)，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成分泌MMP2和MMP9，降解細(xì)胞外基質(zhì)ECM，穿越ECM間隙，從而完成侵襲過程。在前一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本部分實(shí)驗(yàn)通過ELISA、明膠酶譜分析以及RTPCR等方法研究HCV持續(xù)感染對合體滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP2和MMP9合成分泌的影響，探討HCV感染抑制合體滋養(yǎng)層細(xì)咆侵襲能力的具體分子機(jī)制。研究結(jié)果表明HCV持續(xù)感染時(shí)體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP2和MMP9合成與侵襲、粘附、運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)分泌能力下降，為非特異性。因而我們推測細(xì)胞激素合成分泌能力下降所致細(xì)胞分化成熟障礙是細(xì)胞侵襲能力以及侵襲相關(guān)的粘附、運(yùn)動(dòng)能力的下降的主要原因。

簡介：目的本研究通過體外模擬缺氧微環(huán)境，旨在研究缺氧條件對骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞BMEPCS形態(tài)學(xué)、抗凋亡能力、體外血管形成能力等生物學(xué)功能的影響方法1、無菌條件下分離68周齡180220G雄性WISTAR大鼠四肢長骨，PBSE沖洗骨髓腔至白色透亮，經(jīng)密度梯度離心法獲得大鼠骨髓來源單核細(xì)胞，接種在包被有大鼠玻連蛋白的10CM培養(yǎng)皿中，加入特定內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基2。2、隨機(jī)分為常規(guī)培養(yǎng)組和缺氧培養(yǎng)組，常規(guī)培養(yǎng)組于常規(guī)37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7D缺氧培養(yǎng)72H、48H、24H組分別于常規(guī)37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4D、5D、6D后，缺氧1％O25％CO294％N2條件下繼續(xù)培養(yǎng)72H、48H、24H。3、細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34CD133雙陽性標(biāo)記檢測、DIL標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1共同染色，三種方法共同鑒定常規(guī)培養(yǎng)至第7天的BMEPCS細(xì)胞。4、分別觀察常規(guī)培養(yǎng)組、缺氧72H組、缺氧48H組、缺氧24H組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并對以上各組細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮分化功能檢測MATRIGELASSAY、抗凋亡檢測ANNEXINⅤPI，比較各組細(xì)胞生物學(xué)功能變化差異，明確缺氧條件對BMEPCS的功能影響。結(jié)果1、成功分離并獲得各組培養(yǎng)至第7天的大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞，BMEPCS細(xì)胞吞噬DIL標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素1，雙熒光染色細(xì)胞陽性率為90％±4％，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34CD133雙陽性率為86％±2％。2、隨著缺氧處理時(shí)間的延長，BMEPCS早期凋亡率明顯增加。與常規(guī)培養(yǎng)組089±020％相比，缺氧培養(yǎng)24H組早期凋亡率133±007％改變不明顯（P＞005），缺氧培養(yǎng)48H組325±012％、72H組748±153％，早期凋亡率明顯增加（P＜005）。3、隨著缺氧處理時(shí)間的延長，BMEPCS體外血管形成能力變化明顯。與常規(guī)培養(yǎng)組比較，缺氧培養(yǎng)24H組的體外血管形成能力增強(qiáng)P＜001，缺氧培養(yǎng)48H、72H組體外血管形成能力明顯下降P＜001與缺氧培養(yǎng)24H組比較，缺氧培養(yǎng)48H、72H組體外血管形成能力明顯下降（P＜005）。結(jié)論缺氧預(yù)處理BMEPCS24H，BMEPCS早期凋亡率增加不明顯，細(xì)胞體外血管形成能力明顯增強(qiáng)。

簡介：慢性骨疾病如骨質(zhì)疏松、成骨不全等是最為常見的骨代謝異常疾病也是導(dǎo)致骨折和骨缺損的主要原因之一并嚴(yán)重影響到牙齒、牙周組織以及頜骨的健康。骨代謝異常時(shí)可能會(huì)打破自體干細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)從而抑制干細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能影響骨組織的再生與修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCS因其具有自我更新及多向分化潛能已成為骨再生的重要種子細(xì)胞對骨缺損有較好的修復(fù)能力。然而在慢性骨疾病環(huán)境下BMSCS會(huì)因不良的微環(huán)境和局部營養(yǎng)供給的影響而使其生物學(xué)活性和功能受到抑制影響骨修復(fù)能力。近年來發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞EPCS被證實(shí)具有新生血管、促進(jìn)局部營養(yǎng)支持和改善微環(huán)境的功能。因此我們希望可以利用EPCS來促進(jìn)BMSCS的生物學(xué)活性和功能以提高BMSCS的骨再生能力。本實(shí)驗(yàn)通過建立TRANSWELL間接共培養(yǎng)體系來探索EPCS是否具有提高大鼠BMSCSRBMSCS生物學(xué)特性的功能為進(jìn)一步促進(jìn)BMSCS的骨修復(fù)能力奠定理論基礎(chǔ)對開發(fā)治療骨質(zhì)疏松等新的治療策略具有重要意義。研究目的1探討間接共培養(yǎng)條件下EPCS對RBMSCS細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的影響。2探討間接共培養(yǎng)條件下EPCS對RBMSCS干性的調(diào)控作用。3探討間接共培養(yǎng)條件下EPCS對RBMSCS增殖、凋亡、分化的調(diào)控作用。4探討EPCS對RBMSCS體內(nèi)骨修復(fù)能力的影響。研究方法1利用密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)RBMSCS倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面分子的表達(dá)克隆集落形成、MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。成骨、成脂誘導(dǎo)檢測細(xì)胞多向分化能力。2采用密度梯度離心法分離出骨髓中單個(gè)核細(xì)胞利用條件培養(yǎng)基結(jié)合差速貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)和純化EPCS通過對原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的連續(xù)性觀察、細(xì)胞分子表型基因的表達(dá)檢測、體外小管形成實(shí)驗(yàn)以及免疫組化和免疫雙熒光染色等方法對EPCS進(jìn)行綜合鑒定。3建立EPCS、BMSCSTRANSWELL間接共培養(yǎng)體系RTPCR、流式細(xì)胞儀以及DIIACLDL熒光染色檢測BMSCS細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。4間接共培養(yǎng)后RTPCR檢測干性轉(zhuǎn)錄因子在RBMSCS中的表達(dá)情況REALTIMEPCR檢測其基因表達(dá)量的變化EDU熒光標(biāo)記法、CFUF形成率及流式細(xì)胞儀檢測BMSCS增殖及凋亡情況ALP染色、酶活性定量檢測以及茜素紅染色觀察BMSCS堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)的形成情況REALTIMEPCR和WESTERNBLOT檢測成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)量變化油紅O染色觀察EPCS對BMSCS成脂分化的影響REALTIMEPCR和WESTERNBLOT檢測成脂相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)量變化。5建立大鼠牙槽骨缺損模型將經(jīng)EPCS作用過的RBMSCS復(fù)合生物支架材料移植入骨缺損區(qū)通過CMDIL熒光標(biāo)記進(jìn)行細(xì)胞體內(nèi)示蹤對術(shù)后的標(biāo)本組織進(jìn)行大體觀察MICROCT掃描、新骨骨密度檢測以及組織HE染色來檢測BMSCS的骨再生能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1體外分離培養(yǎng)的RBMSCS多呈長梭形、多角形可以形成單細(xì)胞克隆集落細(xì)胞增殖呈典型的S‖形表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物而不表達(dá)造血系細(xì)胞的標(biāo)志物并具有成骨、成脂分化的能力證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCS。2經(jīng)過條件培養(yǎng)基結(jié)合差速貼壁法培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞在原代早期呈長梭形而晚期則轉(zhuǎn)變?yōu)殇伮肥癄睢＜?xì)胞同時(shí)具有造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物的雙重表達(dá)體外可以形成類似微血管樣的結(jié)構(gòu)并且對單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞特異分子免疫組化及雙熒光染色呈陽性表達(dá)證實(shí)所分離培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞為EPCS。3與EPCS間接培養(yǎng)后的BMSCS其細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面分子的表達(dá)與對照組相比沒有明顯差別。因此在間接共培養(yǎng)條件下EPCS并未明顯改變BMSCS的細(xì)胞表型。4間接共培養(yǎng)后EPCS可以有效維護(hù)RBMSCS干性轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)量并增強(qiáng)BMSCS細(xì)胞DNA合成能力和細(xì)胞增殖能力但對BMSCS的凋亡沒有明顯調(diào)控作用。另外EPCS的間接刺激可以有效促進(jìn)RBMSCS體外成骨及成脂分化能力。5EPCS于體外間接作用后可以增強(qiáng)BMSCS在體內(nèi)的骨修復(fù)能力。結(jié)論1間接共培養(yǎng)條件下EPCS不會(huì)改變BMSCS細(xì)胞表型特征。2間接共培養(yǎng)條件下EPCS能夠維持BMSCS的細(xì)胞干性并促進(jìn)其體外增殖及分化能力但對BMSCS的細(xì)胞凋亡沒有影響。3經(jīng)EPCS間接刺激后的BMSCS其修復(fù)牙槽骨缺損的能力明顯提高。

簡介：分類號分類號R73733密級公開密級公開MIR455對宮頸癌宮頸癌SIHA細(xì)胞生物學(xué)特性細(xì)胞生物學(xué)特性的影響的影響及其機(jī)制及其機(jī)制EFFECTSANDMECHANISMSOFMIR455ONTHEBIOLOGICALPROPERTIESOFSIHACERVICALCANCERCELLS作者姓名張康作者姓名張康學(xué)科專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)科專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)導(dǎo)師孟元光教授師孟元光教授指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師韓為東研究員韓為東研究員答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)主席論文答辯日期二論文答辯日期二〇一三年五月一三年五月二十三日二十三日院校地址北京市院校地址北京市海淀區(qū)海淀區(qū)復(fù)興路復(fù)興路28號郵政編碼郵政編碼100853目錄中英文縮略詞表中英文縮略詞表1中文摘要中文摘要2ABSTRACT4前言6第一部分第一部分MIR455在宮頸癌組織中的表達(dá)及在宮頸癌組織中的表達(dá)及SIHA細(xì)胞中表達(dá)水平的變化細(xì)胞中表達(dá)水平的變化10前言10材料與方法10結(jié)果與分析19討論21小結(jié)23第二部分第二部分MIR455對SIHA細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響24材料與方法24結(jié)果與分析26討論29小結(jié)31第三部分第三部分MIR455靶基因的預(yù)測及驗(yàn)證靶基因的預(yù)測及驗(yàn)證32前言32材料與方法32實(shí)驗(yàn)結(jié)果44討論47小結(jié)48全文總結(jié)全文總結(jié)49參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)50綜述綜述54在讀期間發(fā)表論文在讀期間發(fā)表論文63致謝致謝64

簡介：創(chuàng)傷性腦損傷（TRAUMATICBRAININJURY，TBI）是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題。TBI不僅具有較高的患病率和致死率，而且是繼發(fā)性癲癇發(fā)病的一個(gè)重要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在我國，TBI是40歲以下成年人創(chuàng)傷性死亡的主要原因。即使有幸存活下來一部分TBI也將造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失和行為能力的障礙，給家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。目前臨床主要采用對癥支持療法，另外采用積極的院前復(fù)蘇、快速分流、重癥監(jiān)護(hù)也有助于降低死亡率，但這些治療方法仍不能達(dá)到令人滿意的效果。TBI在病理生理學(xué)上可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷兩個(gè)階段。首先原發(fā)性的機(jī)械性創(chuàng)傷會(huì)對局部的神經(jīng)組織造成損害，而損傷本身隨后又會(huì)觸發(fā)一連串的級聯(lián)反應(yīng)，包括神經(jīng)組織缺血、繼發(fā)于彌漫性軸索損傷的WALLERIAN變性、興奮毒性、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體功能障礙和自由基介導(dǎo)的損傷等。繼發(fā)性的腦損傷常發(fā)生在頭部受傷后的數(shù)小時(shí)到數(shù)天的時(shí)間內(nèi)。而且TBI之后神經(jīng)元的喪失不僅僅發(fā)生在損傷局部而且可以彌散到其它腦區(qū)。局灶性損傷典型的特征是損傷區(qū)周圍的灰質(zhì)內(nèi)或灰白質(zhì)交界處的出血。這種局灶性的神經(jīng)元死亡有兩種機(jī)制，迅速的細(xì)胞壞死和進(jìn)程較慢的細(xì)胞調(diào)亡。彌漫性損傷則主要發(fā)生在海馬區(qū)神經(jīng)元，海馬區(qū)的神經(jīng)元對TBI的反應(yīng)尤為敏感，在所有致命的TBI患者中有超過80％存在海馬區(qū)神經(jīng)元的大量喪失，即使在沒有顱高壓存在的情況下亦是如此。這造成的直接后果便是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或患者記憶和認(rèn)知功能的損害。當(dāng)前對TBI治療方法的研究主要基于以上對繼發(fā)性腦損傷的病理生理、分子和細(xì)胞機(jī)制的認(rèn)識(shí)，包括占位性病變的早期發(fā)現(xiàn)和清除防止二次損傷，并嘗試通過藥物來減輕生化和細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)造成的損害。人們普遍認(rèn)為，成年人在損傷后刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生將可能需要一個(gè)或多個(gè)以下的進(jìn)程細(xì)胞更換、提供神經(jīng)營養(yǎng)因子、促進(jìn)軸突導(dǎo)向和去除抑制軸突生長的因素、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的調(diào)控、橋接和材料、和或調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)。自從20年前哺乳動(dòng)物大腦的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞具有自我更新的能力被證實(shí)以來，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)入對神經(jīng)生物學(xué)的研究，例如細(xì)胞替代療法已經(jīng)成為研究和商業(yè)活動(dòng)的一大焦點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明，基于干細(xì)胞移植的治療方法可能是用于治療TBI后功能障礙的最有前途的治療策略之一。細(xì)胞替代療法以如下的治療理念為基礎(chǔ)，即創(chuàng)傷或疾病所引起的神經(jīng)功能缺失可以通過引入新的細(xì)胞來替代喪失的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，或者所引進(jìn)細(xì)胞通過神經(jīng)營養(yǎng)作用來增加受損的神經(jīng)細(xì)胞的存活、可塑性和功能的恢復(fù)來發(fā)揮作用。迄今為止各種類型的干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞目前正在被用于移植研究來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。胚胎干細(xì)胞（EMBRYONICSTEMCELLS，ESC）移植對大鼠的腦損傷功能恢復(fù)有治療作用，但是移植后的腫瘤形成限制了它在人體當(dāng)中的應(yīng)用。另外胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用存在明顯道德倫理障礙和胎兒組織來源不足等問題。最新的研究顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞INDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELLS，IPS）具有ESC的全能性，但是它同樣存在體內(nèi)形成腫瘤的危險(xiǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞NEURALSTEMCELLS，NSC是一個(gè)用來移植治療腦損傷理想的種子細(xì)胞，它既可以分化成神經(jīng)細(xì)胞又可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，但是大量神經(jīng)干細(xì)胞的來源問題目前為止仍然限制了它的應(yīng)用。人間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSC被認(rèn)為是一個(gè)很好作為腦損傷移植治療的備選細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，BMMSC是目前使用最廣泛的種子細(xì)胞。然而抽取骨髓是一個(gè)具有高度侵入性的過程中，存在疼痛和感染的風(fēng)險(xiǎn)，而且其分化的潛能和擴(kuò)增能力都會(huì)隨著年齡的增加而降低。因此尋找BMMSC的替代細(xì)胞已經(jīng)成為一個(gè)研究方向。來自胎盤，胎膜，羊水或胎兒組織細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量、擴(kuò)張潛力和分化能力上都較成體組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞更高。而且它們當(dāng)中的一些細(xì)胞已經(jīng)被用來研究治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)創(chuàng)傷性疾病。盡管胎盤來源的某些間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被用來研究其對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的治療作用，但是目前仍不清楚圍生期組織來源的各種細(xì)胞對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用是否相同。在本研究中，我們將重點(diǎn)比較人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞（AMNIOTICMEMBRANEMESENCHYMALSTEMCELLS，AMMSC）和臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞UMBILICALCDWHARTONSJELLYMESENCHYMALSTEMCELLS，WJMSC的生物學(xué)特性，比較它們的形態(tài)、體外擴(kuò)增能力、免疫表型、和多能性。鑒于神經(jīng)干細(xì)胞是用來移植治療TBI一個(gè)最理想的種子細(xì)胞，我們還比較了這兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的體外神經(jīng)分化潛能，哪種細(xì)胞越容易的分化成神經(jīng)干細(xì)胞，它就越適合作為治療TBI的種子細(xì)胞。細(xì)胞移植治療TBI，除了細(xì)胞替代以外，移植細(xì)胞提供的旁分泌功能也起到一定的作用。MSC被移植到腦損傷區(qū)域后可以提高損傷局部的神經(jīng)營養(yǎng)因子濃度，這對受損細(xì)胞的存活和分化具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)中我們使用人細(xì)胞因子抗體芯片檢測兩種來源間充質(zhì)干細(xì)胞的507個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)。同時(shí)在兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)干的誘導(dǎo)過程中，我們在體外檢測了對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和重建具有關(guān)鍵作用的5個(gè)神經(jīng)營養(yǎng)因子。它們是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BRAINDERIVEDNEUROTROPHICFACT，BDNF、神經(jīng)生長因子NERVEGROWTHFACT，NGF、神經(jīng)營養(yǎng)因子3（NEUROTROPHIN3，NT3）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GLIALCELLDERIVEDNEUROTROPHICFACT，GDNF）和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子CILIARYNEUROTROPHICFACT，CNTF。這一結(jié)果將在一定程度上對于TBI損傷修復(fù)中種子細(xì)胞的選擇提供一定的參考，尤其是在神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌方面。同時(shí)這也反映神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)過程對不同細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子能力的影響。另一方面移植入體內(nèi)干細(xì)胞的存活能力也是干細(xì)胞移植治療需要考慮的重要方面。間充質(zhì)干細(xì)胞的移植治療效果往往被植入細(xì)胞的大量損失所限制，細(xì)胞的死亡是由于損傷部位的惡劣微環(huán)境所引發(fā)。本研究中我們通過過氧化氫和去血清培養(yǎng)兩種方式來模擬過氧化應(yīng)激和局部的缺血缺氧環(huán)境，并比較了兩種來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外的抗凋亡能力。抗凋亡能力強(qiáng)的干細(xì)胞更適合體內(nèi)移植治療TBI。本研究包括三個(gè)部分第一部分AMMSC和WJMSC的分離、培養(yǎng)和鑒定。目的建立一種簡單有效的分離培養(yǎng)AMMSC和WJMSC的方法，觀察其形態(tài)，檢測其表面抗原標(biāo)記的表達(dá)情況，觀察培養(yǎng)過程中核型的變化，比較兩種細(xì)胞體外增殖能力，觀察其表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)，并檢測它們中胚層多向分化能力。方法對與羊膜細(xì)胞的分離我們采用24UML中性蛋白酶、10MGML膠原酶A和001MGML脫氧核糖核酸酶依次消化來分離對于華通膠細(xì)胞的分離我們采用Ⅱ型膠原酶和0125％胰酶EDTA依次消化的方法來分離。通過光學(xué)顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并通過原子力顯微鏡ATOMICFCEMICROSCOPE，AFM對細(xì)胞表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對兩種分離得到的細(xì)胞的表面抗原進(jìn)行檢測，并通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對其表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志的情況進(jìn)行檢測。通過測定體外累積群體倍增來對兩種細(xì)胞體外增殖能力進(jìn)行比較，并對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行核型分析。我們對兩種MSC的中胚層多向分化能力進(jìn)行的檢測，包括向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化能力。結(jié)果通過上述的方法我們成功的分離培養(yǎng)出AMMSC和WJMSC。兩種細(xì)胞都呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，相比之下WJMSC形態(tài)更加細(xì)長并具有更加強(qiáng)的折光性。對細(xì)胞表面抗原檢測，我們發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的表達(dá)情況相類似，它們表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，不表達(dá)血液和內(nèi)皮系統(tǒng)的表面抗原（CD19、CD31、CD34和CD45），表達(dá)Ⅰ類抗原HLAABC但不表達(dá)Ⅱ類抗原HLADR。通過對兩種細(xì)胞向中胚層多向分化能力的檢測，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞都能夠向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞方向分化。以上結(jié)果與國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)對間充質(zhì)干細(xì)胞的定義和標(biāo)準(zhǔn)相符合，這說明我們從上述組織中分離出的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示兩種細(xì)胞都強(qiáng)烈表達(dá)波形蛋白10000±000％VS10000±000％，少量的AMMSC和WJMSC表達(dá)NESTIN2873±297％VS1922±296％T2265P0053、SOX22058±243％VS2111±251％T0154P0881和MUSASHI11017±310％VS1262±258％，T0609，P0559，兩組之間NESTIN在AMMSC中陽性率較高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AFM掃描結(jié)果顯示，AMMSC具有更強(qiáng)的粘附能力，在細(xì)胞的生長過程中邊緣胞體有更長的偽足伸出，這提示其可能具有更強(qiáng)的遷移能力。體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WJMSC具有更高的體外增殖能力（F817948，P＜0001）。在細(xì)胞培養(yǎng)的各個(gè)階段我們都對細(xì)胞進(jìn)行了核型分析，未發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)對其正常核型的產(chǎn)生影響。結(jié)論我們成功分離出AMMSC和WJMSC，分離出的細(xì)胞符合MSC的標(biāo)準(zhǔn)，包括表面抗原的表達(dá)情況和中胚層多向分化的能力。AMMSC具有更強(qiáng)的粘附能力，并可能有更強(qiáng)的體內(nèi)遷移能力而WJMSC則具有更強(qiáng)的體外增殖能力。兩種細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下都能保持正常的二倍體核型。第二部分AMMSC和WJMSC向神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的比較。目的建立一種誘導(dǎo)AMMSC和WJMSC分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法。通過這種方法我們想找到神經(jīng)干細(xì)胞的新的來源，另外我們比較兩種來源間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。檢測在誘導(dǎo)過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)量的變化情況。方法間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法如下AMMSC和WJMSC培養(yǎng)在神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有KNOCKOUTTMDMEMF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20NGML人上皮細(xì)胞生長因子HUMANEPIDERMALGROWTHFACT，EGF、20NGML人成纖維細(xì)胞細(xì)胞生長因子HUMANBETAFIBROBLASTICGROWTHFACT，BFGF、神經(jīng)干細(xì)胞添加劑STEMPRONSCSFM和GLUTAMAXTMⅠ添加劑1∶100同時(shí)含有1％的青鏈霉素，在37℃和5％CO2置于25CM2超低粘附力表面的培養(yǎng)瓶中。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。誘導(dǎo)10天后，收集神經(jīng)球通過實(shí)時(shí)定量PCR和酶聯(lián)免疫吸ENZYMELINKEDIMMUNOADSDENTASSAY，ELISA附實(shí)驗(yàn)來檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)水平。結(jié)果AMMSC和WJMSC可以被誘導(dǎo)成神經(jīng)球（一種神經(jīng)干細(xì)胞的生長方式），羊膜來源的神經(jīng)干細(xì)胞（AMNIONDERIVEDNEURALSTEMCELLS，AMNSC）和臍帶華通膠來源的神經(jīng)干細(xì)胞UMBILICALCDWARTONSJELLYDERIVEDNEURALSTEMCELLS，AMNSC。而且這種誘導(dǎo)得到的神經(jīng)球具有神經(jīng)干細(xì)胞的大部分特征。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示AMMSC和WJMSC經(jīng)過誘導(dǎo)之后表達(dá)三種神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志。經(jīng)過神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)之后與未誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志表達(dá)明顯上調(diào)。細(xì)胞免疫化學(xué)具體結(jié)果如下AMNSC與AMMSC相比表現(xiàn)更強(qiáng)的NESTIN、SOX2和MUSASHI熒光信號NESTIN，9205±275％VS2873±297％P＜0001SOX27017±316％VS2058±243％P＜0001MUSASHIL，6694±362％VS1017±310％，P＜0001）WJNSC與WJMSC相比表現(xiàn)更強(qiáng)的NESTIN、SOX2和MUSASHI熒光信號（NESTIN，8357±260％VS1922±296％P＜0001SOX27117±363％VS2111±251％P＜0001MUSASHI6415±381％VS1262±258％，P＜0001）。有意思的是誘導(dǎo)后AMNSC與WJNSC相比表現(xiàn)更強(qiáng)的NESTIN熒光信號但SOX2和MUSASHI未見顯著差異NESTIN，921±282％VS836±2252％P00497SOX2702±326％VS712±354％，P0816MUSASHI1，670±367％VS640±389％，P0559）。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果和WESTERNBLOT結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致。對兩種來源細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)前后分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力的變化情況進(jìn)行的檢測。我們檢測了BDNF、GDNF、NT3、CNTF和NGF。具體的ELISA結(jié)果如下AMMSC分泌因子的情況，BDNF，10951±1526PGML，GDNF3285±1421PGMLNT32743±1191PGMLCNTF3962±1356PGML和NGF2146±983PGML誘導(dǎo)之后AMNSC分泌因子情況，BDNF，47739±3995PGMLGDNF10101±1167PGMLNT320633±2636PGMLCNTF16048±2269PGML和NGF18523±2359PGM。WJMSC分泌因子情況，BDNF24169±2590PGMLGDNF1621±1001PGMLNT317235±2520PGML，CNTF3437±1142PGML和NGF10559±1824PGML誘導(dǎo)之后WJNSC分泌因子情況，BDNF，33366±3159PGML，GDNF9364±1917PGML，NT312246±2002PGML，CNTF23128±2207PGML和NGF3276±1017PGML。組間比較結(jié)果顯示誘導(dǎo)前WJMSC與AMMSC相比表達(dá)高的BDNFP0006、NT3P＜0001和NGFP0002。而有意思的是誘導(dǎo)后AMNSC卻比WJNSC表達(dá)更高的BDNFP0003、NT3P0015、CNTFP0014和NGFP0009。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果與上述的ELISA結(jié)果一致。結(jié)論成功的將AMMSC和WJMSC誘導(dǎo)為AMNSC和WJNSC。這些誘導(dǎo)得到的NSC與未誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比表達(dá)更高的NSC標(biāo)志。誘導(dǎo)之前WJMSC和AMMSC相比表達(dá)更多的BDNF、NT3和NGF，然而誘導(dǎo)之后AMNSC卻比WJNSC表達(dá)更高的BDNF、NT3、CNTF和NGF。由此可見來自新生兒附屬組織不同部位的間充質(zhì)干細(xì)胞對同一神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)方法的反應(yīng)不完全相同，相比之下AMMSC對神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)的反應(yīng)更有利于神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌。第三部分AMMSC和WJMSC體外細(xì)胞因子抗體芯片檢測和抗凋亡能力的檢測。目的運(yùn)用人細(xì)胞因子抗體芯片對兩種來源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力進(jìn)行檢測。通過過氧化氫和去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)AMMSC和WJMSC凋亡，并檢測其抗凋亡能力。方法使用人細(xì)胞因子抗體芯片HUMANL507ARRAY，RAYBIOTECHINC檢測兩種間充干細(xì)胞所分泌的507種細(xì)胞因子。我們用化學(xué)發(fā)光的方法來探測膜上的信號強(qiáng)度，信號的強(qiáng)度通過光密度計(jì)來進(jìn)行定量。對于數(shù)值差別在兩倍以上的因子，我們對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。我們選用陽性對照對來自各張膜的數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本實(shí)驗(yàn)中采用2MMOLL的H2O2和去血清培養(yǎng)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸生物素缺口末端標(biāo)記法TUNEL和ANNEXINV和PROPIDINE碘PI染色來進(jìn)行測定。結(jié)果細(xì)胞因子抗體芯片的結(jié)果如下與WJMSC相比AMMSC中檢測到有23種細(xì)胞因子高表達(dá)差異倍數(shù)在兩倍以上而在WJMSC中有49種細(xì)胞因子相對AMMSC高表達(dá)差異倍數(shù)在兩倍以上。在AMMSC中高表達(dá)的23種細(xì)胞因子中，有4種因子差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而在WJMSC中兩倍以上高表達(dá)的49種因子，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在AMMSC中上調(diào)的4種因子為白細(xì)胞介素INTERLEUKIN，IL或者白細(xì)胞介素的受體。具體的細(xì)胞因子如下IL6T3546P0038IL13RALPHA2T3336P0045IL12P70T3743P0033IL22RT3187，P00498。H2O2誘導(dǎo)凋亡后，TUNEL法檢測AMMSC和WJMSC細(xì)胞凋亡率2794±231％VS3570±227％，T2401，P0043，ANNEXINVPI染色方法檢測細(xì)胞凋亡率3131±205％VS3952±265％，T2448，P0040去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)凋亡后，ANNEXINVPI染色方法檢測細(xì)胞凋亡率（823±091％VS1171±113％，T2396，P0043）。結(jié)果顯示AMMSC無論在過氧化氫還是去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中都比WJMSC顯示更強(qiáng)的抗凋亡能力。結(jié)論與WJMSC相比AMMSC表達(dá)更多的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子主要為細(xì)胞介素，它們可能與細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)有關(guān)。AMMSC比WJMSC具有更強(qiáng)的抗凋亡能力。

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簡介：分類號R392密級內(nèi)部2年學(xué)位類別科學(xué)學(xué)位囹?qū)I(yè)學(xué)位口學(xué)校代碼10062學(xué)號2011602067學(xué)科門類醫(yī)學(xué)又坪眚斜袁鼉秘纛撇L麓黼簍羹籟翟娃鼙麓黻囂器萋科碩士學(xué)位論文MSTER’SDISSERTATION論文題目ER亞型對MCF7的生物學(xué)特性及其分泌THL／TH2類細(xì)胞因子的影響TITLEEFFECTSOFESTROGENRECEPTORSUBUINTSONTHEBIOLOGICALBEHAVIORSANDTHL／TH2TYPECYTOKINESECRETIONOFMCF7一級學(xué)科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)二級學(xué)科免疫學(xué)論文作者宋娟指導(dǎo)教師鄧為民教授導(dǎo)師組成員李宏釗副教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二O一四年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要目的以人乳腺癌細(xì)胞株MCF7作為親本細(xì)胞，采用SIRNA干擾技術(shù)構(gòu)建不同雌激素受體ER亞型ERCT／ERL3的穩(wěn)定表達(dá)株，探討不同ER亞型對MCF7的生物學(xué)特征及其分泌THL／TH2類細(xì)胞因子的影響。方法本實(shí)驗(yàn)以ERA和E鄧穩(wěn)定表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF一7為親本細(xì)胞株。以PGENESIL1質(zhì)粒為載體，將針對ERA或ERL3的SIRNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入MCF7，沉默ERA或ERL3基因，建立不同ER亞型的穩(wěn)定表達(dá)株，并命名為M／HKERA“19H／ERL3KGH，陰性對照、M／SIAERAL。W／ERPHIGH及M／SIL3ERAMGH／ERL310W。以此為基礎(chǔ)，做如下實(shí)驗(yàn)1采用WESTERNBLOT技術(shù)檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。2采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。3采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況。4利用二步法IMPCR檢測凋亡抑制基因BCL2、BCLXL和XIAP的表達(dá)情況。5采用雙層軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外成瘤能力。6采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的黏附能力。7采用雙抗體夾心ELISA法檢測IFN，、／和IL4的分泌情況。勿士甲皇日7R1WESTERNBLOT檢測結(jié)果顯示，M／SIA和M／SILL細(xì)胞ERA或ERL3的最高干擾效率為777％和683％，而M／HK細(xì)胞ER表達(dá)水平?jīng)]有變化。說明成功構(gòu)建了ERA／ERP不同表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株。2MTT分析結(jié)果顯示，經(jīng)24H、48H培養(yǎng)，M／SIA細(xì)胞O550008，060土0008和M／SIL3細(xì)胞O580008，0690001的增殖活性與M／HK細(xì)胞0560004，063士0002相比無顯著差異胗O05；經(jīng)72H、96H培養(yǎng)，M／SIA細(xì)胞071士0098，081士0087的增殖活性與M／HK細(xì)胞088士0145，107士0156相比降低PO01，M／SIL3細(xì)胞101士0086，123土0124的增殖活性增強(qiáng)P001。