簡(jiǎn)介：897228舟糞號(hào)●■■論文編號(hào)自敏彳鷹犬善學(xué)位論文宣塑墟塹煎生塹煎壘盛塑照盔睦壘蕉盟麴照生塹堂適睦壁塞SYNTHES】SOFNEWFUUERENEDERLVMIVESANDSTUD”SONLHE”C”O(jiān)TOⅢ叭R“IOIIOLⅧCAJCEⅡULARACNⅥIV研究生姓名；倪瑾指導(dǎo)教9I姓名；墓建睡熬援蘊(yùn)三星醫(yī)盤堂照射醫(yī)生熬班童土瀣蠱趨股盥旦旦型QL申請(qǐng)學(xué)位類別墁專業(yè)名稱趣齄里岜論文提交日期，星鯉鯉巨L且一論文答辯日期；2006年5月學(xué)位授于單位和日期T鼙三呈匡盤堂2Q堂生月～OO六年H槲眭聲明Y897228本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名、F諺彩移簽字日期B6年C月1日學(xué)位論文使用授權(quán)書聲明本人完全了解第二軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)第二軍醫(yī)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書學(xué)位論文作者簽名、噶萬移導(dǎo)師簽名簽字日期口易年6月／日簽字日期碰本C5月F日

簡(jiǎn)介：博士學(xué)位論文學(xué)校代碼學(xué)號(hào)白血病干細(xì)胞標(biāo)志的研究P53對(duì)GRO生物學(xué)作用的影響所院姓名指導(dǎo)教師導(dǎo)師小組學(xué)科專業(yè)研究方向完成日期血液學(xué)研究所支蕾龐天翔王建祥教授秘營昌王敏饒青病理學(xué)與病理生理學(xué)白血病的基因治療與免疫治療二OO年五月L0023B2007383第一部分白血病干細(xì)胞標(biāo)志的研究STUDYONTHECEUMARKERSOFLEUKEMIASTEMCEUS

簡(jiǎn)介：中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名互塹日期趁Z羔≥／／中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名互盞指導(dǎo)教師簽名弦蘊(yùn)丞日期J衛(wèi)叫中文論著摘要姜黃素對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠卵巢癌細(xì)胞系增殖和遷移能力的影響及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制的研究刖吾卵巢上皮癌來源于卵巢上皮細(xì)胞，目前，對(duì)其發(fā)生癌變的分子生物學(xué)機(jī)制還不是十分明確。由于其發(fā)生存在遺傳復(fù)雜性及基因突變多元性，為此，本研究應(yīng)用了一個(gè)新的細(xì)胞體系，該體系以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將多種確定可引起遺傳突變的一系列常見癌基因轉(zhuǎn)染到P53基因敲除的雌性成年大鼠的卵巢表面上皮細(xì)胞內(nèi)。要生成這種具有遺傳定義的卵巢上皮癌細(xì)胞系，通過將編碼人類C．MYC原癌基因，鼠K．RAS剛2D以及姒標(biāo)記的鼠十四烷?；疉KT．1癌基因轉(zhuǎn)染到由K5．TVA．P53敲除的大鼠分離出的卵巢上皮細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)目前的研究結(jié)果已證實(shí)，單獨(dú)轉(zhuǎn)染C．MYC，KRAS或AKT基因其中的一種，并不能使P53敲除的大鼠卵巢表面上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變，然而，轉(zhuǎn)染至少這三個(gè)癌基因中的任意兩種，可使卵巢表面上皮細(xì)胞表型發(fā)生癌變。大鼠卵巢癌細(xì)胞系的生成如下CI基因型P53．／，CMYC,KRAS，C2基因型P53／,C．MYC,ALA，C3基因型P53／,KRAS,A／A。將CI，C2和C3細(xì)胞注射于裸鼠腹腔內(nèi)，所有結(jié)果表明其形成的腹腔擴(kuò)散癌組織與女性III期卵巢癌非常相似。同時(shí)，與人卵巢癌相似的是，腫瘤很少發(fā)生肝臟或脾臟轉(zhuǎn)移，而只局限于腹腔，松散的附著于腹膜表面、腸系膜和生殖器官。組織學(xué)顯示，來自CL和C2細(xì)胞的腹腔腫瘤類似卵巢漿液性乳頭狀癌，這是女性卵巢癌最常見的類型。來自C3細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤類似低分化卵巢癌。由C1，C2和C3來源的腫瘤結(jié)節(jié)分離后，進(jìn)行體外培養(yǎng)，形成TL，T2和T3腫瘤細(xì)胞系。K．RAS原癌基因是RAS基因家族成員之一，致癌譜廣泛，活化多發(fā)生于卵巢癌的早期且同組織類型有關(guān)。近年對(duì)激素受體的研究發(fā)現(xiàn)激素信號(hào)系統(tǒng)和RAS的信號(hào)通路存在相互作用，ZAEEHOS等在人卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌組織中發(fā)現(xiàn)類固醇激素可直

簡(jiǎn)介：浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特征的初步研究姓名蘇燕燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師丁克峰20060501浙二工大學(xué)碩士學(xué)位論文人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特征的初步研究浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)碩士研究生蘇燕燕研究生導(dǎo)師丁克峰中文摘要胃腸道間質(zhì)瘤GASTROINTESTINALTRACTTUMORS，GIST是人類胃腸道最常見的問葉性腫瘤。GIST發(fā)病的主要機(jī)制是由于原癌基因C一艇R突變性激活致使突變細(xì)胞增殖失控所形成的。GIST的C一般R基因突變率超過85％，突變主要發(fā)生在外顯子11、9、13和17，但C一垃￡基因突變引起KIT蛋白的激活機(jī)制尚未有研究報(bào)道。在GIST，有少；_【J分檢測(cè)不出C脅基因突變，在這些GIST中，約為7％存在血小板生I受因子受體APDGFR4基因的突變。除此之外，最近的研究表明還有一些蛋白和基因如HMGBL，COX一2，HSP90，CARP等參與了GIST的發(fā)病和進(jìn)展，但是其作用機(jī)制尚不清楚。GIST對(duì)放療和普通化療均不敏感，主要依靠手術(shù)治療，但術(shù)后50％的患者會(huì)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。而針對(duì)酪氨酸激酶的分子靶向藥物一格列衛(wèi)的出現(xiàn)使得GIST的治療和頸后明顯改觀。大量的臨床病例研究表列格列衛(wèi)治療GIST有效安全。目前格列衛(wèi)已被公認(rèn)為治療GIST的～一線藥物。然而最近STL571在治療GIST過程中出現(xiàn)繼發(fā)耐藥的現(xiàn)象不斷增加，產(chǎn)生耐藥性是GIST病人治療中最主要的挑戰(zhàn)，但是具體的耐藥機(jī)制尚不清楚。因此建立體外培養(yǎng)的GIST細(xì)胞系可以為進(jìn)一步研究GIST的發(fā)病機(jī)制和研究對(duì)格列衛(wèi)的耐藥機(jī)制，為設(shè)計(jì)新的藥物來防止和克服格列衛(wèi)耐藥提供一個(gè)較理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。目前國外已建立的GIST細(xì)胞株有GIST882、GIS■T1、GIST780，其中GIST882是較為經(jīng)典的細(xì)胞系，但是GIST882體外培養(yǎng)困難。我們中國人的GIST細(xì)胞株尚未有建立的報(bào)道。因此我們建立了GIST細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特征的初步探討。目的建立GIST細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特征的初步探討。

簡(jiǎn)介：背景游離脂肪組織移植是臨床上具有廣泛用途的一種方法，但因移植后的脂肪組織吸收率高、造成供區(qū)繼發(fā)畸形等缺點(diǎn)而受到限制。組織工程技術(shù)的發(fā)展為脂肪組織移植指明了前景。目前已證實(shí)脂肪組織來源的干細(xì)胞（S）具有體內(nèi)外多向分化潛能，但目前所能獲得的S是位于人脂肪組織內(nèi)的一個(gè)混雜細(xì)胞群體，只有大約40的細(xì)胞能向脂肪細(xì)胞分化。因此，S并不能完全滿足脂肪組織工程的發(fā)展需要，尋找一種增殖能力強(qiáng)、成脂分化率高、易于分離的更理想的種子細(xì)胞仍然是研究熱點(diǎn)。脂肪組織內(nèi)除了含有上述的干細(xì)胞外，其主要成分是成熟脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞因大量的脂質(zhì)聚集而具有漂浮性，難以體外培養(yǎng)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為脂肪細(xì)胞是處于分化終末階段，缺乏增殖能力的一種細(xì)胞。然而，國外有研究表明，成熟脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中，能發(fā)生脂質(zhì)分解變化，重新啟動(dòng)增殖機(jī)制并分裂增殖。這種生理轉(zhuǎn)變被稱為脂肪細(xì)胞去分化，由去分化得到的細(xì)胞被稱為去分化脂肪細(xì)胞（DA）。廖云君等的研究證實(shí)DA在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)下具有向成脂、成骨、成軟骨分化等多向分化能力，且較之S有更高的成脂能力。因此，DA有可能成為脂肪組織工程更具前景的種子細(xì)胞來源。然而，目前國內(nèi)外對(duì)如何高效提純成熟脂肪細(xì)胞并獲取DA、DA的多向分化潛能的研究還很少，尚未見應(yīng)用DA作為種子細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行組織工程化脂肪組織的構(gòu)建。本研究將針對(duì)上述問題進(jìn)行探討。目的1通過從人脂肪抽吸物的脂質(zhì)部分分離、提純成熟脂肪細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究脂肪細(xì)胞去分化現(xiàn)象，探討脂肪細(xì)胞去分化的原理和方法。2通過對(duì)DA的形態(tài)觀察和定向誘導(dǎo)，探討DA的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和多向分化潛能。3通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將DA與FG可注射性支架混合后注射于裸鼠皮下試構(gòu)建組織工程化脂肪，探討DA作為脂肪組織工程種子細(xì)胞的可行性和潛力。方法從成人吸脂術(shù)后的抽吸物提取成熟脂肪細(xì)胞及S，天花板貼壁培養(yǎng)法使成熟脂肪細(xì)胞去分化，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并獲得DA。油紅“O”染色、阿爾辛藍(lán)染色、茜素紅染色分別鑒定DA成脂分化、成軟骨、成骨分化分化結(jié)果；光鏡及掃描電鏡檢測(cè)DA及S與FG支架的相容性；將DIⅠ熒光染料標(biāo)記過的DAFG混合物（A組，N8，細(xì)胞量410S）和SFG混合物（B組，N8，細(xì)胞量4106）以及空白FG支架（C組，N8）注射于裸鼠皮下。8周后將新生組織取出，給予大體觀察和濕重測(cè)定，HE染色、H染色和油紅“O”染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察、纖維化比率定量測(cè)定和熒光顯微鏡觀察以鑒定新生物的性質(zhì)、來源。結(jié)果人成熟脂肪細(xì)胞在天花板貼壁法培養(yǎng)下能去分化為成纖維細(xì)胞狀細(xì)胞，經(jīng)過多向分化誘導(dǎo)檢測(cè)證實(shí)該細(xì)胞為DA。成脂分化兩周，油紅“O”染色可見DA內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴；成軟骨分化兩周，阿爾辛藍(lán)染色可見DA內(nèi)軟骨基質(zhì)沉積成骨分化三周，茜素紅染色可見DA內(nèi)出現(xiàn)紅色鈣鹽沉積。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中A組和B組8周后在裸鼠背部皮下均有新生組織塊形成，濕重的X±S分別為01249±00190（G）和00971±00166（G）（F12350，P001）。纖維化比率的X±S分別為1420±2625和2589±5314（F34678，P0001）。C組未見新生組織形成，支架被完全吸收。新生組織經(jīng)檢測(cè)后證實(shí)其為成熟脂肪塊并來源于植入的種子細(xì)胞。結(jié)論1從成人脂肪抽吸物脂質(zhì)部分中可以分離、提純得到大量的成熟脂肪細(xì)胞。2成熟的脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可去分化為DA，DA呈成纖維細(xì)胞狀，增殖活性強(qiáng)，并具有多向分化能力。3DA與FG支架混合后注射于裸鼠皮下能初步形成組織工程化脂肪；較之S，DA構(gòu)建出的脂肪塊具有濕重大，纖維化比率低等優(yōu)點(diǎn)。DA是脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞。

簡(jiǎn)介：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文CD97SIRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞株MKN45生物學(xué)特性的影響及其分子機(jī)制的初步研究姓名龔道軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)普通外科學(xué)指導(dǎo)教師陳力20090501浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要重要作用。然而，CD97對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其內(nèi)在機(jī)制仍然有待于闡明。第一章CD97SIRNA轉(zhuǎn)染對(duì)人胃癌細(xì)胞株MKN45增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響目的設(shè)計(jì)合成有效的CD97SIRNA，體外轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株，觀察CD97表達(dá)變化及其對(duì)體內(nèi)、外胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響。方法1采用人胃癌細(xì)胞株MKN45，針對(duì)CD97基因設(shè)計(jì)SIRNA，采用化學(xué)法合成，篩選出最有效的CD97SIRNA。2CD97SIRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞48小時(shí)后，用RTPCR檢測(cè)CD97基因在MRNA水平表達(dá)的變化，72小時(shí)后用WESTERNBLOT和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)CD97基因在蛋白水平表達(dá)的變化，并用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的變化，用細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。315只裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，分別接種轉(zhuǎn)染SIRNACD97細(xì)胞抑制組，接種轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照SIRNACD97細(xì)胞陰性對(duì)照組，接種未轉(zhuǎn)染細(xì)胞正常對(duì)照組。接種4周后，觀察各組成瘤情況，比較成瘤率。結(jié)果1CD97一SIRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，RTPCR方法檢測(cè)結(jié)果表明CD97在MRNA水平表達(dá)下降7012％；72小時(shí)后，WESTERNBLOT方法檢測(cè)結(jié)果表明CD97在蛋白水平的表達(dá)下降6635％。2CD97SIRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞增殖率下降5245％；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，GL期細(xì)胞數(shù)量在未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和CD97SIRNA轉(zhuǎn)染組分別是1448士345％、1533士213％和3979士305％，S期細(xì)胞數(shù)量分別是6417士336％、6035士521％和2856士133％，出現(xiàn)GLS期阻IX

簡(jiǎn)介：|FILLLIIIIILLUIILLLLLIFLLL0Y2663104中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名王絲』砑日期型坐羔塑中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期型生翌中文論著摘要BECLINL基因過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其分子機(jī)制的初步研究目的結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，以40歲～50歲年齡組發(fā)病率最高，全球每年新發(fā)病例約800萬人，占所有惡性腫瘤的10％15％。結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，死亡率僅次子肺癌和肝癌，占我國惡性腫瘤第三位。BECLINL基因也稱BECNL基因，是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因。BECLINL不僅參與自噬體的形成，還可通過調(diào)節(jié)自噬活性對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。關(guān)于自噬基因BECLINL與非小細(xì)胞肺癌，乳腺癌，宮頸癌等都有了相關(guān)的研究，但BECLINL與結(jié)腸癌在體內(nèi)外關(guān)系的研究還很少。本研究旨在利用BECLINL基因在結(jié)腸癌細(xì)胞HCTL5和HCTLL6細(xì)胞中過表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的自噬、凋亡、侵襲、生長活性及相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以此來研究BECLINL基因過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，初步探索自噬基因BECLINL的在結(jié)腸癌中的分子機(jī)制。方法設(shè)計(jì)特異引物利用RTPCR方法從HCTL5細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄BECLINLCDNA，并連接到PUCM．T載體中，進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序。將測(cè)序正確的PUCM．BECLINL克隆DNA及PCDNA3．1／MYC．HIS質(zhì)粒DNA擴(kuò)增，分別進(jìn)行ECORI、XBAI雙酶切，純化BECLINL和PCDNA3．1／MYCHIS片段，連接，轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增，酶切鑒定及測(cè)序。將構(gòu)建的BECLINL質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCTL5、HCTLL6細(xì)胞并進(jìn)行G418篩選建立穩(wěn)定克隆細(xì)胞系，在DNA水平進(jìn)行鑒定，分別在RNA水平和蛋白水平上對(duì)PCDNA3．1／MYCHISBECLINL質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，篩選獲得BECLINL高表達(dá)結(jié)腸癌陽性克隆細(xì)胞株，并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，用WESTERNBLOT檢測(cè)LC3BII、LC3BI蛋白表達(dá)，，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)自噬蛋白LC3B表達(dá)，電鏡下觀察克隆細(xì)胞株亞細(xì)胞形態(tài)變化；用ANNEXINVFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)；用細(xì)胞增殖試劑盒CCK檢測(cè)細(xì)胞生長；采用TRANSWELL侵襲實(shí)驗(yàn)來研究BEDIM基因過表

簡(jiǎn)介：目的1、鑒定大鼠鼻中隔呼吸粘膜是否存在外胚層呼吸粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞。2、比較大鼠外胚層來源的呼吸粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞與中胚層來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外生物學(xué)特性及成神經(jīng)分化的能力。方法1、自SPRAGUEDAWLEYSD大鼠鼻中隔和雙股骨內(nèi)分別提取、分離、培養(yǎng)外胚層呼吸粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞RESPIRATYMUCOSADERIVEDMESENCHYMESTEMCELLSRMMSCS和中胚層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BONEMARROWDERIVEDMESENCHYMESTEMCELLSBMMSCS。2、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增RMMSCS和BMMSCS利用流式細(xì)胞技術(shù)、MTT方法比較其基本生物學(xué)特性。3、將RMMSCS和BMMSCS向神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化并利用免疫熒光技術(shù)、RTPCR、WESTERNBLOT等方法比較兩種不同胚層來源干細(xì)胞成神經(jīng)分化的能力。結(jié)果1、SD大鼠鼻中隔呼吸部粘膜中存在RMMSCS。2、RMMSCS與BMMSCS在短時(shí)間培養(yǎng)內(nèi)生長速度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P005。3、短時(shí)間神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后RMMSCS較BMMSCS更易于分化成神經(jīng)細(xì)胞和分泌更多的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BRAINDERIVEDNEUROPHICFACTBDNF。結(jié)論本研究初步證實(shí)大鼠鼻中隔呼吸部粘膜中存在RMMSCS。大鼠RMMSCS可以在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞。與BMMSCS相比原代RMMSCS高表達(dá)神經(jīng)譜系標(biāo)記基因經(jīng)短期神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后RMMSCS更易于分化成神經(jīng)細(xì)胞和分泌更多的BDNF。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)學(xué)號(hào)M201175500學(xué)校代碼10487密級(jí)碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文雌激素撤退雌激素撤退對(duì)轉(zhuǎn)染表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)染表達(dá)BRAFBRAFV600EV600E的結(jié)腸結(jié)腸上皮細(xì)胞生物學(xué)特征的影響上皮細(xì)胞生物學(xué)特征的影響學(xué)位申請(qǐng)人周豪學(xué)科專業(yè)胃腸外科微創(chuàng)外科指導(dǎo)教師蔡開琳副教授答辯日期2014年5獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，本學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果的總結(jié)。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對(duì)本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本人將承擔(dān)本聲明引起的一切法律后果。本學(xué)位論文工作受國家自然科學(xué)基金“雌激素撤退對(duì)BRAF激活性突變后結(jié)腸CIMPMSIH腫瘤發(fā)生的影響（項(xiàng)目編號(hào)81272655，主持人蔡開琳）”項(xiàng)目支持。學(xué)位論文作者簽名日期年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)華中科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□，在_____年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密□。（請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“√”）學(xué)位論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期年月日日期年月

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多TIMP-1 siRNA、Smad7及反義TIMP-1聯(lián)合對(duì)肝星狀細(xì)胞生物學(xué)活性影響的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用、多基因參與、經(jīng)歷多個(gè)階段的復(fù)雜生物學(xué)過程，有許多信號(hào)分子參與其中。積極探討這些信號(hào)分子對(duì)細(xì)胞的作用和機(jī)制，及其信號(hào)分子之間的相互關(guān)系，將有助于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。S100蛋白家族是一類具有EF手形結(jié)構(gòu)的信號(hào)分子，有25個(gè)成員，與鈣離子及其靶蛋白結(jié)合后發(fā)揮多種生理功能，參與細(xì)胞增殖和分化、鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化、酶活性和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。其中21個(gè)成員的基因定位于人染色體LQ21，該區(qū)段染色體穩(wěn)定性差，易發(fā)生多種染色體重排和基因擴(kuò)增。現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)多個(gè)S100成員在腫瘤中表達(dá)異常，并與腫瘤的增殖、浸潤轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān)，S100A2和S100A6就是其中的兩個(gè)成員。S100A2在多種腫瘤中表達(dá)減少或缺失，如惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤，且S100A2的缺失表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，消減雜交也提示S100A2為腫瘤抑制因子；但也有相反報(bào)道。S100A6蛋白最初由KUZNICKI和FILIPEK在EHRLICH腹水瘤中檢出。它在多數(shù)上皮腫瘤如黑色素瘤、肝癌、結(jié)直腸腫瘤、胰腺癌、膽管癌、多數(shù)骨肉瘤、卵巢癌、RAS轉(zhuǎn)化的MIH3T3細(xì)胞、SV4O轉(zhuǎn)化的鼠成纖維細(xì)胞和人急性粒細(xì)胞白血病等許多腫瘤中高表達(dá)，但它與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。為了進(jìn)一步探討S100A2和S100A6對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用及其可能的機(jī)制，本課題擬通過重組蛋白直接作用的方式和或腺病毒轉(zhuǎn)入基因的方式，研究人S100A2和S100A6對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡等的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。希望能夠?yàn)殛U明S100A2和S100A6對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為發(fā)現(xiàn)腫瘤診斷和預(yù)后判斷的新標(biāo)志物以及腫瘤治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。方法1HS100A2和HS100A6蛋白的鑒定和制備雙酶切鑒定PGSTMOLUCHS100A2和PGSTMOLUCHS100A6后，將二者轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，異丙基ΒD硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)S100A2和S100A6蛋白表達(dá)，谷胱甘肽瓊脂糖4B球珠GLUTATHIONESEPHAROSE4BBEADS分離純化、十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SODIUMDODECYLSULFATEPOLYACRYLAEGELELECTROPHESIS，SDSPAGE和WESTERNBLOT鑒定這兩種重組蛋白，BRADFD法定量，分裝后80℃保存?zhèn)溆谩?利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增攜帶S100A6基因的重組腺病毒ADS100A6，并用SDSPAGEWESTERNBLOT鑒定在感染了ADS100A6的HCT116中S100A6的表達(dá)。3GST谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、GSTHS100A2、GSTHS100A6、表達(dá)GFP的重組腺病毒ADGFP、ADS100A6分別作用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63后其中，蛋白終濃度為40ΜGML，分別用MTT法和臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)HCT116和MG63細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變PI染色和凋亡的發(fā)生ANNEXINVPE細(xì)胞活性檢測(cè)試劑7AAD；TRANSWELL小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；激光共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)ΜCATENIN的變化。結(jié)果1XHOⅠ和ECⅠ雙酶切PGSTMOLUCHS100A2和PGSTMOLUCHS100A6后，均出現(xiàn)約300BP和9KB的片段，與其限制性內(nèi)切圖譜相符；誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化后的重組蛋白經(jīng)過SDSPAGEWESTERNBLOT鑒定，分別出現(xiàn)相應(yīng)的陽性雜交條帶。表明這兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確，能表達(dá)出相應(yīng)蛋白HS100A2和HS100A6；BRADFD法蛋白定量，計(jì)算出HS100A2和HS100A6的獲率分別為5MGL菌液和3MGL菌液。2在感染了ADS100A6的HCT116裂解液中，用SDSPAGEWESTERNBLOT法檢測(cè)到HS100A6的存在。表明ADS100A6攜帶的HS100A6基因能夠正常表達(dá)。3外源性S100A2和S100A6對(duì)細(xì)胞增殖的影響HS100A2和HS100A6分別作用HCT116時(shí)，HS100A2的重組蛋白組于第4天始出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制，與GST組的差異有顯著性P005，S期呈降低的趨勢(shì)。5外源性S100A2和S100A6對(duì)HCT116凋亡的影響HS100A2和HS100A6重組蛋白作用HCT116細(xì)胞48H時(shí)，凋亡率分別是對(duì)照組的23倍和20倍，差異顯著P005；ADS100A6組的凋亡率是對(duì)照組的113倍，呈增加趨勢(shì)。提示HS100A2和HS100A6有促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡的作用；S100A6以重組蛋白直接作用與基因轉(zhuǎn)入的方式對(duì)細(xì)胞凋亡的作用一致。6外源性S100A2和S100A6對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響HS100A2重組蛋白分別作用HCT116和MG63細(xì)胞60H后，穿過膜的細(xì)胞數(shù)分別較各自對(duì)照組減少75％和83％，差異均具有顯著性P001。提示HS100A2對(duì)HCT116和MG63細(xì)胞有較強(qiáng)的遷移抑制作用。HS100A6重組蛋白分別作用HCT116和MG63細(xì)胞60H后，其穿過膜的細(xì)胞數(shù)分別較各自對(duì)照組減少14％和33％；ADS100A6組48H分別較各自對(duì)照組減少56％和37％，差異均有顯著性P001。提示HS100A6能明顯抑制HCT116和MG63細(xì)胞的遷移，其重組蛋白直接作用與基因轉(zhuǎn)入的方式對(duì)細(xì)胞遷移能力的作用一致。7兩種重組蛋白作用MG63后，免疫熒光染色，LEICACONFOCALSOFTWARE計(jì)算各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度HS100A2組、HS100A6組分別是對(duì)照組的15和16倍，差異有顯著性P005；激光共聚焦顯微鏡與透射光鏡下觀察GST組的ΒCATENIN主要位于胞漿中和核膜上，核內(nèi)ΒCATENIN集中呈現(xiàn)1～2個(gè)亮點(diǎn)，似聚集在核仁部位；細(xì)胞核膜完整，核仁1～2個(gè)；兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ΒCATENIN的變化相似胞漿ΒCATENIN熒光著色增強(qiáng)，核內(nèi)ΒCATENIN也明顯增加，呈現(xiàn)3～4個(gè)亮點(diǎn)，似位于核仁；但是，原來位于核膜上的ΒCATENIN明顯減少甚至消失，并且細(xì)胞核膜欠完整，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的核仁為3～4個(gè)。結(jié)論1S100A2和S100A6能一定程度地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63的增殖、改變其細(xì)胞周期分布G0G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少和促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其中，對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用可能參與了S100A2和S100A6對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。2S100A2和S100A6能較明顯地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63的運(yùn)動(dòng)遷移能力，其中S100A2的作用更強(qiáng)。3S100A2和S100A6能增加骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞內(nèi)ΒCATENIN的總含量，并改變其分布，最終表現(xiàn)為胞漿和胞核內(nèi)ΒCATENIN表達(dá)增加，核膜上的表達(dá)明顯減少，胞核中的表達(dá)似聚集在核仁。4外源性S100A6以重組蛋白直接作用的方式與以基因轉(zhuǎn)入的方式均有同樣活性。提示S100A6是又一個(gè)能夠在細(xì)胞外發(fā)揮作用的S100家族成員；如用于臨床目的，兩種作用方式均適用。本課題通過MTT法或臺(tái)盼蘭細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)、TRANSWELL小室探討了S100A2和S100A6作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63后細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、凋亡和遷移能力的變化，并用激光共聚焦技術(shù)探討了細(xì)胞內(nèi)ΒCATENIN的變化，發(fā)現(xiàn)S100A2和S100A6能夠一定程度地抑制HCT116和MG63的增殖、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)凋亡，后二者可能是其抑制細(xì)胞增殖的部分機(jī)制；S100A2和S100A6能明顯地抑制HCT116和MG63的遷移；S100A2和S100A6能增加骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞內(nèi)ΒCATENIN的總含量，并改變其分布；同時(shí)，首次報(bào)道了S100A6的細(xì)胞外作用。本研究及其結(jié)果為闡明S100A2和S100A6對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及其機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)密級(jí)國際十進(jìn)分類號(hào)（UDC）第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性及牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性及牙周再生中應(yīng)用的研究牙周再生中應(yīng)用的研究（題名和副題名）王蕾（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名段銀鐘教授金巖教授指導(dǎo)教師單位第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)名稱口腔臨床醫(yī)學(xué)（正畸）論文提交日期201004答辯日期201005論文起止時(shí)間2008年4月至2010年4月學(xué)位授予單位第四軍醫(yī)大學(xué)牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性及牙周再生中應(yīng)用的研究及牙周再生中應(yīng)用的研究研究生王蕾學(xué)科專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)（正畸）所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科導(dǎo)師段銀鐘教授（主任醫(yī)師）金巖教授（主任醫(yī)師）資助基金項(xiàng)目資助基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30725042）關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞牙周膜干細(xì)胞；牙槽骨；牙根；組織工程；牙周再生中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)2010年5月

簡(jiǎn)介：廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文米非司酮對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞生物學(xué)行為及順鉑敏感性的影響姓名況玉蘭申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師關(guān)婷20090601廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文米非司酮對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞生長及順鉑敏感性的影響P005。3免疫組化方法結(jié)果顯示125MG／L和25MG／L米非司酮作用于HEC1B細(xì)胞48小時(shí)后，BCL一2和KI一67蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異無顯著性P005。5MG／L20MG／L米非司酮作用48小時(shí)后，BCL一2及硒67蛋白的表達(dá)水平明顯下降P005。結(jié)論米非司酮一5MG／L時(shí)，具有抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞生長和促進(jìn)凋亡作用，能使細(xì)胞周期阻滯于GO／GL期。無細(xì)胞毒性濃度125MG／L和2SMG／L米非司酮能增強(qiáng)順鉑對(duì)HEC1B細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。其作用機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期、調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。關(guān)鍵詞米非司酮、子宮內(nèi)膜癌、順鉑、化療增敏性、凋亡4

簡(jiǎn)介：東南大學(xué)碩士學(xué)位論文肝癌細(xì)胞自噬小體的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性研究姓名丁磊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)免疫學(xué)指導(dǎo)教師王立新20090608東南大學(xué)碩士學(xué)位論文性標(biāo)志物一LC3．II的水平；7．淋巴結(jié)注射DRIBBLE方法免疫BALB／C小鼠，2周后皮下注射DRIBBLE增強(qiáng)免疫，檢測(cè)小鼠血清中抗HBS抗體的產(chǎn)生情況；8．以HBSAG預(yù)先免疫小鼠，收獲免疫小鼠的脾臟及淋巴結(jié)，制成混合淋巴細(xì)胞懸液，以可溶性HBSAG、DRIBBLE或裂解物體外刺激72小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并以ELISA法檢測(cè)其IFN_丫與IL．4水平；9．磁珠分選出免疫小鼠的CD8與CD4T細(xì)胞，上述抗原與DC共孵育6小時(shí)后洗去抗原，然后與T細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)，檢測(cè)上清中IFN．Y與IL．4含量；10．以D黜BBLE預(yù)先免疫小鼠，收獲免疫小鼠的淋巴細(xì)胞，體外分別用可溶性HBSAG、DRIBBLE以及細(xì)胞裂解液刺激72小時(shí)，ELISA法檢測(cè)其IFNQ與IL_4。結(jié)果1．透射電子顯微鏡觀察到含雙層膜結(jié)構(gòu)的小體，提示有效地提取了自噬小體／D硒BBLE2．熒光定量PCR檢測(cè)到HEPG2．215細(xì)胞中含有高水平的HBSAG．DNA，而從DRIBBLE中未檢測(cè)到HBSAG．DNA；3．ELISA法檢測(cè)HBSAG顯示蛋白酶體抑制劑能夠阻斷HBSAG短壽蛋白的降解，自噬誘導(dǎo)劑能夠促進(jìn)自噬小體的形成及外排，NH4CL能夠阻止溶酶體對(duì)自噬小體中蛋白的降解，從而使自噬小體生成增多、降解減少，HBSAG蛋白含量相應(yīng)地增加；4．WESTEMBLOT檢測(cè)HBSAG顯示在蛋白酶體抑制劑作用下，HBSAG短壽片段得以保留，N】瞰CL抑制溶酶體對(duì)自噬小體中蛋白的降解，使HBSAG長短片段均得以富集；在各組細(xì)胞裂解物中，均檢測(cè)到自噬特異性標(biāo)記物L(fēng)C3，且以胞漿型的LC3．I為主，NIHCL處理組LC3含量最多；在各組DRIBBLE中，檢測(cè)到的LC3以膜結(jié)合型的LC3．II為主，且NH4CL處理組LC3．II的含量明顯高于其他組；5．DRIBBLE免疫小鼠血清能檢測(cè)到高水平的抗HBS抗體；6．DRIBBLE在體外單獨(dú)刺激HBSAG免疫小鼠淋巴細(xì)胞時(shí)能夠產(chǎn)生高水平的IFNY和低水平的IL_4，IFN,水平顯著高于可溶性HBSAG刺激組和細(xì)胞裂解液刺激組，而且DRIBBLE的最強(qiáng)刺激劑量是可溶性HBSAG的1／300；7．DC／DRIBBLE和DC／HBSAG刺激HBSAG特異性CD4T細(xì)胞產(chǎn)生的IFNQ水平無明顯差別；但DC／DRIBBLE刺激HBSAG特異性CD8T細(xì)胞產(chǎn)生的IFNY水平顯著高于DC／HBSAG刺激組和細(xì)胞裂解液刺激組；8．體外用DRIBBLE對(duì)DRIBBLE免疫小鼠淋巴細(xì)胞進(jìn)行再刺激時(shí)可產(chǎn)生高水平的IFN．Y，而細(xì)胞裂解液則不能很好地活化T細(xì)胞，僅產(chǎn)生很少量的IFN,。結(jié)論1．蛋白酶體抑制劑聯(lián)合自噬誘導(dǎo)劑和NH4CL能促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬小體的形成，降低蛋白酶體對(duì)HBSAG的降解，并誘導(dǎo)自噬小體的釋放；2．DRIBBLE作為一種新型交叉提呈的抗原載體，體外誘導(dǎo)HBSAG特異性CD8T細(xì)胞活化的能力明顯優(yōu)于可溶性HBSAG以及腫瘤細(xì)胞裂解液。關(guān)鍵詞自噬與自噬小體；LC3；肝癌細(xì)胞；樹突狀細(xì)胞；交叉提呈II

簡(jiǎn)介：骨骼肌組織工程的醫(yī)學(xué)介入在改善移植細(xì)胞的質(zhì)量和生存方面擁有巨大潛力。目前在骨骼肌三維培養(yǎng)、體外大塊組織構(gòu)建等方面面臨巨大的挑戰(zhàn)使各種因?yàn)樵斐傻氖Ч趋兰〗M織功能的重建缺乏功能性組織代用品而受阻。運(yùn)用組織工程替代品體內(nèi)修復(fù)缺失的肌肉功能是有困難的1、再建肌肉組織需要具有天然組織結(jié)構(gòu)和充分的再生能力；2、組織結(jié)構(gòu)進(jìn)入宿主后缺乏活力和相容性。許多學(xué)者在骨骼肌的體外構(gòu)建和替代研究方面做了大量研究試圖創(chuàng)建功能化的肌組織DENNIS和KOSNIK等12探索出三維骨骼肌組織的自組裝模式將成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并包裹形成肌管橫向電刺激時(shí)產(chǎn)生持續(xù)的興奮和收縮；德國的BACH34鍆研究組進(jìn)行了成肌細(xì)胞與纖維蛋白三維支架的復(fù)合培養(yǎng)獲得具有極性分化功能的多核肌管；SXENA采用聚乙醇酸網(wǎng)與成肌細(xì)胞復(fù)合并進(jìn)行體內(nèi)移植獲得血管化的骨骼肌樣組織。盡管國外學(xué)者已涉及骨骼肌組織工程三維構(gòu)建研究但都處于初級(jí)摸索階段國內(nèi)目前尚沒有體外骨骼肌三維構(gòu)建的文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于國內(nèi)外現(xiàn)狀我們實(shí)驗(yàn)組在體外三維骨骼肌的構(gòu)建方面進(jìn)行初步的探索。眾所周知骨骼肌組織工程包括三要素即干細(xì)胞、支架、生長因子。細(xì)胞與支架材料的相互作用是組織工程研究的主要領(lǐng)域其目的是使細(xì)胞能在基質(zhì)材料上貼附和正常生長。體外條件下能否獲取極性、平行排列的分化肌管是三維肌組織構(gòu)建成功的關(guān)鍵因?yàn)榧±w維的平行排列特性是肌組織發(fā)揮收縮功能的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。我們實(shí)驗(yàn)組運(yùn)用修飾后的硅酮彈性體作為三維支架與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)獲取極性肌管。硅酮彈性體SYLGARD184有柔性基底層特征表面光滑并具有一定的彈性便于檢測(cè)細(xì)胞移動(dòng)和加載產(chǎn)生的牽拉力5。前期的實(shí)驗(yàn)篩選了SYLGARD184支架修飾包被的最佳基質(zhì)材料使成肌細(xì)胞與基質(zhì)材料具良好相容性；并掌握細(xì)胞在材料表面的增殖、分化特性初步探索了體外構(gòu)建肌組織的可能性。在此基礎(chǔ)上我們將進(jìn)一步完善骨骼肌的體外三維構(gòu)建優(yōu)化極性平行肌管培養(yǎng)方法改善SYLGARD184鑄槽技術(shù)。通過修飾后的鑄槽對(duì)分化期C2C12細(xì)胞的極性誘導(dǎo)、促分化、促延展作用獲取高密度、極性分化、具備收縮蛋白和生肌轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)能力的肌管使其結(jié)構(gòu)更接近在體生理狀態(tài)并檢測(cè)分析SYLGARD184三維基質(zhì)材料對(duì)成肌干細(xì)胞生長分化的影響。為更優(yōu)化體外肌組織類似物的構(gòu)建我們嘗試應(yīng)用具良好生物相容性、降解特性、在組織工程研究領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用的生物支架材料PGA與C2C12進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)探討體外相容性和構(gòu)建的可行性。同時(shí)進(jìn)行三維和傳統(tǒng)平面培養(yǎng)兩種不同的培養(yǎng)方法獲取肌管檢測(cè)成肌轉(zhuǎn)錄因子和生肌標(biāo)志蛋白表達(dá)從成肌特性、收縮功能等方面進(jìn)行分析比較研究三維與平面培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)及功能差異為下一步的三維肌組織構(gòu)建和應(yīng)力拉伸研究提供理論和技術(shù)支持。這種體外培養(yǎng)三維極性肌管成分比較單一可以避免其他因素的干擾是研究肌細(xì)胞和肌組織自身功能活性的良好模型有助于我們了解細(xì)胞發(fā)育中的一些基本原理。所構(gòu)建的肌組織模型進(jìn)一步研究有望能夠替代體外骨骼肌組織加載相應(yīng)處理因素為各種肌病的病因研究模擬病理學(xué)條件。我們的主要研究內(nèi)容第一章硅酮彈性體SYLGARD184三維基質(zhì)材料對(duì)成肌干細(xì)胞生長分化的影響目的鑄型并修飾的SYLGARD184與C2C12細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)獲取三維極性肌管并檢測(cè)分析硅酮彈性體三維基質(zhì)材料對(duì)成肌干細(xì)胞生長分化的影響。方法SYLGARD184雙組分以101的比例均勻混合倒入6孔板中半固化時(shí)對(duì)SYLGARD184表面進(jìn)行壓痕鑄型每條鑄槽長25RAM寬08MM深1MM置生物安全柜完全固化MATRIGEL和膠原混合液均勻鋪被凹槽底部紫外線照射備用。接種密度為1X106ML的C2C12細(xì)胞懸液細(xì)胞融合80％時(shí)加入含2％馬血清的DMEMF12分化培養(yǎng)以獲取極性肌管。倒置顯微鏡、HE染色觀察肌管的分化狀態(tài)及結(jié)構(gòu)RTPCR、免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果SYLGARD184凹槽表面生長的C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化10D后鏡下可見融合為多核、極性生長的肌管；20D時(shí)可見肌管明顯增粗、成熟、極性平行分布相互融合形成肌組織類似物有自主收縮性。HE染色可見平行的肌管內(nèi)有大量細(xì)胞核存在PCR檢測(cè)到MYOD、MYOGENINMRNA陽性表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)極性肌管內(nèi)分化特異性標(biāo)志蛋白MYOGENIN、成肌特異性蛋白FACTIN、MHC表達(dá)密集表明構(gòu)建的肌組織類似物有成肌特征和收縮性。結(jié)論鑄型的SYLGARD184凹槽具有一定的方向引導(dǎo)效應(yīng)復(fù)合培養(yǎng)C2C12細(xì)胞能誘導(dǎo)分化形成多核、重疊、極性肌管。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)修飾的SYLGARD184三維支架為成肌干細(xì)胞提供賴以寄宿、增殖和分化的場(chǎng)所具有良好的生物相容性能增進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖引導(dǎo)多核肌管極性生長促進(jìn)肌樣分化誘導(dǎo)組織再生所獲得的骨骼肌組織類似物具有肌組織的生物學(xué)特性其結(jié)構(gòu)更接近在體生理狀態(tài)。為下一步成功構(gòu)建較大體積的體外三維肌組織模型奠定基礎(chǔ)。第二章聚羥基乙酸PGA與成肌干細(xì)胞的體外相容性研究目的觀察成肌干細(xì)胞在聚羥基乙酸PGA上的粘附生長情況及在體外形成肌組織類似物的能力。方法將松散的PGA纖維纏繞固定在蓋玻片表面確保纖維的平行排列和維持一定的張力。PGA纖維束長3CM直徑約02CM。碘酒、乙醇浸泡消毒01％PBS沖洗Ⅰ型膠原和MATRIGEL混合物包被紫外線消毒30MIN。加入含10％FBS的DMEMF12培養(yǎng)基置37℃5％CO2孵箱預(yù)培養(yǎng)3D。接種C2C12細(xì)胞濃懸液與PGA材料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)、分化掃描電鏡下觀察C2C12細(xì)胞與PGA的粘附生長情況。結(jié)果PGA纖維束接種C2C12細(xì)胞后倒置顯微鏡下可見細(xì)胞生長狀態(tài)良好均勻粘附于纖維表面及空隙中細(xì)胞橢圓至梭形沿PGA纖維縱軸方向向兩極伸展與材料相容良好PGA纖維與貼壁生長的細(xì)胞之間無間隙和距離。分化培養(yǎng)7D后對(duì)分化形成的肌組織類似物行掃描電鏡可見PGA纖維表面有較多的貼附生長的成肌細(xì)胞肌管沿PGA平行排列方向生長融合形成膜狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛肌管的分化不均一長短、直徑不一致分化肌管存活良好。成肌干細(xì)胞與PGA纖維有較好的生物相容性。結(jié)論P(yáng)GA是目前應(yīng)用最為廣泛的組織工程支架材料其良好的生物相容性、降解特性和體內(nèi)良好歸宿獲得組織工程研究者的青睞。由于PGA纖維能夠平行排列成束有極性誘導(dǎo)效應(yīng)且細(xì)胞懸液易于滲透有利于成肌干細(xì)胞的體外生長和極性分化。掃描電鏡初步證實(shí)了成肌細(xì)胞在PGA表面的良好生物相容性和極性分化潛能肌管極性生長融合成肌膜狀結(jié)構(gòu)表明PGA纖維作為支架材料用于體外肌組織構(gòu)建的可行性。第三章成肌干細(xì)胞體外三維及平面培養(yǎng)的比較研究目的比較三維與平面培養(yǎng)C2C12細(xì)胞形態(tài)及功能差異。方法Ⅰ型膠原和MATRIGELMATRIX修飾SYLGARD184鑄槽和普通培養(yǎng)皿分別接種C2C12細(xì)胞懸液細(xì)胞增殖至80％融合時(shí)換含2％馬血清的DMEMF12誘導(dǎo)分化獲取成熟的肌管；倒置顯微鏡觀察肌管形態(tài)RTPCR方法檢測(cè)MYOD、MYOGENIN基因MRNA的表達(dá)免疫熒光檢測(cè)成肌特異性蛋白MYOD、MYOGENIN、DESMIN、FACTIN、MHC和NACHR等的表達(dá)。結(jié)果SYLGARD184鑄槽表面的C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化5D倒置顯微鏡下可見肌管融合多核、極性生長趨勢(shì)；17D后肌管增粗成熟、極性平行融合形成肌組織類似物有自主收縮性；掃描電鏡見肌管之間排列緊密、重疊厚03MM具有三維性；而平面培養(yǎng)分化3D后倒置顯微鏡下可見肌管融合分化7D達(dá)成熟峰值肌管小而排列紊亂。RTPCR檢測(cè)三維和平面培養(yǎng)MYOD、MYOGENINMRNA均陽性表達(dá)但三維培養(yǎng)的表達(dá)更強(qiáng)；MYOD、MYOGENIN、DESMIN、FACTIN、MHC和NACHR等特異性蛋白檢測(cè)顯示極性肌管內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)更密集。結(jié)論相對(duì)于傳統(tǒng)的平面培養(yǎng)三維極性肌管的生存時(shí)間、功能表達(dá)、肌管間的細(xì)胞連接更加優(yōu)化。三維培養(yǎng)有較高的細(xì)胞成活率、肌管呈極性平行分布特征有利于成肌細(xì)胞的體外極性分化和肌管間細(xì)胞連接的形成肌管存活時(shí)間長且一管多核有利于成肌分化因子和收縮蛋白的表達(dá)其結(jié)構(gòu)更接近其生理狀態(tài)且無其他細(xì)胞或組織成分的干擾肌管純度高并具備自主收縮性進(jìn)一步研究有望成為骨骼肌的發(fā)生發(fā)育、應(yīng)力加載和骨骼肌肌病良好的體外研究模型。