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簡介：利用成體干細胞進行細胞替代治療或聯(lián)合基因治療是近幾年提出的修復(fù)組織損傷的新思路。基于成體干細胞的治療策略能否安全、有效的達到目的在很大程度上取決于我們對成體干細胞增殖與分化的分子機制的認識。細胞分化的核心問題是基因表達在時間和空間上的精確調(diào)控，一種新的細胞表型的建立需要相關(guān)調(diào)控基因的打開和關(guān)閉以適應(yīng)新的功能。近年來發(fā)現(xiàn)，一類叫做MICRNAS的非編碼小RNA分子，在調(diào)控特定細胞增殖、分化進程等方面起著重要作用，特別是其在維持干細胞定向分化和自我更新功能中的作用逐漸被揭示，成為目前干細胞研究中的一個新的亮點和熱點。某些MIRNAS具有組織表達分布的特異性，提示它們與該組織的分化和特定功能的維持有關(guān)。早期的MIRNAS克隆結(jié)果和基于高通量芯片的組織表達譜分析顯示，MIR1，MIR133和MIR206在小鼠的肌肉組織呈特異性表達，而它們在肌肉發(fā)育、增殖和分化中的作用尚知之不多。明確這些MIRNAS在成體干細胞增殖分化中的作用，將為我們利用成體干細胞進行相關(guān)肌損傷修復(fù)治療提供新的線索。本課題擬利用肌母細胞C2C12體外成肌分化模型，檢測肌肉組織特異性表達的MIRNAS在成肌分化中的表達變化，通過GAINOFFUNCTION觀察部分肌肉組織特異性表達的MIRNAS對成肌分化的影響，并利用生物信息學(xué)和相關(guān)實驗手段預(yù)測、分析和驗證它們可能的靶基因，同時檢測這些MIRNAS在某些肌肉損傷過程中的表達變化，并構(gòu)建相應(yīng)的治療性載體，初步探討其在促進成肌分化中的意義，為進一步探明MIRNAS調(diào)控骨骼肌增殖與分化的分子機制、探索成體干細胞定向分化的新策略提供理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)。本研究內(nèi)容主要包括三部分一、肌肉組織特異性MIRNAS在C2C12細胞體外成肌分化過程中的表達改變建立C2C12細胞體外成肌分化和以TNFΑ為干預(yù)因素的抑制分化模型，通過形態(tài)學(xué)改變，肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學(xué)和肌分化相關(guān)基因的RTPCR對上述模型進行評價，采用NTHERNBLOT檢測肌肉組織特異性的MIR1、MIR133和MIR206在上述模型的表達變化情況。二、MIR1和MIR206促進成肌分化的作用和機制研究根據(jù)上述研究結(jié)果并結(jié)合最新進展，確定進一步深入研究MIR1和MIR206在成肌分化過程中的功能?；瘜W(xué)合成MIR1和MIR206，將其以200NM的濃度分別轉(zhuǎn)染至C2C12細胞，形成GAINOFFUNCTION狀態(tài)后進行誘導(dǎo)分化，采用形態(tài)學(xué)、肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學(xué)和肌肉功能蛋白SKELETALΑACTIN的WESTERNBLOT對其分化效應(yīng)評價。采用生物信息學(xué)方法，利用軟件PITAR、MIRA和TARGETSCAN42分析MIR1和MIR206可能作用的候選靶基因。根據(jù)上述研究結(jié)果并結(jié)合最新進展，分析候選靶基因在成肌分化過程中及過表達MIR1和MIR206后的變化特點，進一步篩選與MIR1和MIR206表達相關(guān)聯(lián)的基因。利用熒光素酶報告系統(tǒng)驗證候選靶基因。為了明確熒光素酶報告系統(tǒng)的敏感性和特異性，構(gòu)建陽性對照質(zhì)粒PMIR206LUCREPTER。將位于候選靶基因3‘UTR含有預(yù)測MIR1和206作用位點約500BP區(qū)域克隆至PMIRLAC內(nèi)熒光素酶3UTR，并進行酶切和測序驗證。三、檢測肌肉組織特異性MIRNAS在骨骼肌失神經(jīng)萎縮中的表達變化并構(gòu)建MIR1的腺病毒表達載體進行促成肌分化的初步研究。建立小鼠腓腸肌去神經(jīng)支配萎縮模型，NTHERNBLOT檢測MIR1、MIR133和MIR206在該模型的表達變化。著眼于以后的治療應(yīng)用，利用PCR從小鼠基因組擴增含有MIR11的DNA片段，連接至PADTRACKCMV中后轉(zhuǎn)化含PADEASY1的感受態(tài)BJ5183，通過同源重組獲得腺病毒載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293包裝病毒顆粒，NTHERNBLOT驗證成熟MIR1表達情況。利用MIR1重組腺病毒感染C2C12細胞，誘導(dǎo)分化72H通過形態(tài)學(xué)、肌球蛋白重鏈免疫熒光組織化學(xué)和肌肉功能蛋白SKELETALΑACTIN的WESTERNBLOT等指標(biāo)評價其對分化的影響。通過以上三部分的實驗研究與分析，獲得以下主要結(jié)果1、成功建立C2C12細胞體外成肌分化和以TNFΑ為干預(yù)因素的抑制分化模型。C2C12細胞以2％馬血清進行成肌分化誘導(dǎo)，35D可見多核肌管，MHC免疫熒光呈胞漿陽性，RTPCR檢測MYOD、MYOG和SKELETALΑACTIN分化相關(guān)基因誘導(dǎo)分化后表達明顯上調(diào)，證實我們所建立的C2C12細胞成肌分化模型是成功的。另一方面，觀察到TNFΑ是C2C12細胞成肌分化的負向調(diào)控因子。TNFΑ作用后上述成肌分化相關(guān)的標(biāo)志分子均不同程度受到抑制，建立了應(yīng)用TNFΑ抑制成肌分化的模型，用于后續(xù)研究。2、明確了肌肉組織特異性MIRNASMIR1，MIR133和MIR206在上述模型的表達變化。在正常成肌分化模型中三者隨著誘導(dǎo)時間的延長，在分化過程中表達量升高明顯；在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中加入20NGMLTNFΑ后成肌分化受抑，三者表達也受到明顯抑制。3、揭示MIR1和206能夠促進成肌分化。在C2C12細胞轉(zhuǎn)染化學(xué)合成MIR1和206后24H進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)48H后進行效應(yīng)評價。結(jié)果顯示，在TNFΑ組，轉(zhuǎn)染MIR1和206后與陰性對照比較，MHC陽性細胞數(shù)目明顯較多，SKELETALΑACTIN水平分別為對照的137倍和123倍。在TNFΑ組，各組MHC陽性細胞數(shù)目明顯少于TNFΑ組，轉(zhuǎn)染MIR1和206后與陰性對照比較，MHC陽性細胞數(shù)目明較多，SKELETALΑACTIN表達水平分別為對照的208倍和169倍，加入TNFΑ這一干預(yù)因素后，凸顯了MIR1和206的促分化效應(yīng)。4、發(fā)現(xiàn)CCND1和FOXP1是MIR1和MIR206作用的靶基因。利用在線生物信息學(xué)軟件PITAR、MIRA和TARGETSCAN42預(yù)測MIR1和MIR206可能作用的靶基因，并結(jié)合其在成肌分化過程中的表達變化特點確定CCND1和FOXP1兩個基因做進一步深入研究。進一步通過GAINOFFUNCTION研究證實CCND1和FOXP1符合靶基因的表達變化特點。進而，將CCND1和FOXP1的3UTR含有預(yù)測作用位點約500BP的片段常規(guī)方法連接到PMIRLUC的熒光素酶3UTR，成功構(gòu)建PMIRLUCCCND13UTR、PMIRLUCFOXP1YUTR1和PMIRLUCFOXP13UTR2等3個重組質(zhì)粒。分別與PMIRΒGAL及合成之MIRNAS共轉(zhuǎn)染293細胞，計算分析LUCΒGAL值，結(jié)果顯示，對PMIRLUCCCND13’UTRMIR1和MIR206可使其熒光素酶活性分別下降477％和393％；對PMIRLUCFOXP13UTR2MIR1和MIR206可使其熒光素酶活性分別下降469％和407％；MIR1和MIR206未對PMIRLUCFOXP13UTR1的熒光素酶活性造成影響。5、明確在小鼠腓腸肌去神經(jīng)支配所致骨骼肌萎縮過程中肌肉組織特異性MIRNAS的表達變化情況。與對照組相比，MIR206隨著失神經(jīng)支配時間的延長其在肌肉組織中的表達明顯上調(diào)，第28D其強度可達到對照的5倍以上；MIR1和MIR133隨著失神經(jīng)支配時間的延長其表達先迅速下調(diào)，而后逐漸回升，但至失神經(jīng)支配后第28D仍明顯低于正常水平。6、成功構(gòu)建MIR1的腺病毒表達載體，并初步觀察利用其促進C2C12分化的作用，為以后利用其進行實驗治療打下基礎(chǔ)。利用PCR在小鼠基因組中擴增含有MIR11的DNA片段，正確連接至穿梭質(zhì)粒PADTRACKCMV中，然后轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒PADEASY的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，通過同源重組產(chǎn)生腺病毒載體質(zhì)粒PADEASYMIR11，轉(zhuǎn)染293細胞后包裝出重組腺病毒PADMIR11，感染293后行NTHERNBLOT驗證成熟MIR1分子能夠高效表達。制備高滴度病毒顆粒感染C2C12，誘導(dǎo)成肌分化72H進行評價，結(jié)果表明，感染ADMIR1后MHC陽性細胞數(shù)目增多，SKELETALΑACTIN水平為對照的121倍；加入TNFΑ后，ADMIR1組細胞MHC陽性細胞數(shù)目明顯增多，ΑACTIN接近對照不加入TNFΑ的水平，表明ADMIR1可以明顯促進成肌分化。研究結(jié)論如下1、成功建立C2C12細胞體外成肌分化和TNFΑ干預(yù)分化的模型，明確了肌肉組織特異性MIRNAS在上述模型的表達變化特點。2、明確MIR1和206是促進成肌分化的正向調(diào)控因素，CCND1和FOXP1是它們的兩個靶基因。3、揭示肌肉組織特異性MIRNAS在小鼠腓腸肌去神經(jīng)支配所致骨骼肌萎縮過程中的表達變化情況，為從MIRNAS角度研究去神經(jīng)支配所致骨骼肌萎縮的機制提供了新的思路。4、成功構(gòu)建MIR1的腺病毒表達載體并初步研究了其促進成肌分化的作用，為應(yīng)用MIRNAS基因治療促進肌損傷的修復(fù)打下了基礎(chǔ)。

簡介：目的膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶ANTERICRUCIATELIGAMERLT，ACL重建手術(shù)，采用相同直徑移植物與不同大小骨隧道相匹配，觀察移植物肌腱與周圍骨壁的愈合情況，分析腱骨愈合機制和結(jié)果，以期尋找兩者之間的最佳匹配關(guān)系。方法選取16只成年雄性家犬，隨機分配到4個組ABCD組，每組4只。A組骨隧道直徑為5MM，B組骨隧道直徑為45MM，C組骨隧道直徑為4MML，D組骨隧道直徑為35MM，按序骨隧道直徑遞減05MM。采用自體中L／3跟腱作為移植物，修整為相同直徑大小4MM。每只狗作雙膝ACL重建模型。術(shù)后6周和12周，每組各處死2只狗。切取膝關(guān)節(jié)ACL重建標(biāo)本作大體、組織學(xué)觀察和生物力學(xué)測試，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果ACL重建6周時，腱骨愈合界面出現(xiàn)SHARPEY樣纖維連接。A、B組骨隧道與移植物間距大，愈合界面中膠原纖維數(shù)量少。D組的膠原纖維較其他組致密有序，骨隧道壁上新生編織骨連接成片，其生物力學(xué)測試結(jié)果也優(yōu)于同期各組。ACL重建12周時，A組L例標(biāo)本出現(xiàn)股骨外側(cè)髁軟骨面損傷。組織學(xué)觀察，各組腱骨愈合界面基本成熟，出現(xiàn)了類軟骨樣細胞。A、B、C組的腱骨界面中細胞和膠原纖維排列仍然雜亂無序。D組的SHARPEY樣纖維連接致密有序，界面中類軟骨樣細胞有排列成行的趨勢。但尚未觀察到有分區(qū)和“潮線”形成。結(jié)論在ACL重建中，采用小于移植物直徑的骨隧道，肌腱與骨隧道之間緊密壓配，能提供更加穩(wěn)定的生物力學(xué)環(huán)境，防止肌腱在骨隧道內(nèi)的微動，增加腱骨愈合接觸面積，改善壓應(yīng)力分布，減少關(guān)節(jié)液對腱骨愈合的影響，從而加快腱骨愈合界面的形成和改造，提高腱骨愈合質(zhì)量。

簡介：腫瘤、創(chuàng)傷、感染、先天性疾病、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)等導(dǎo)致的骨缺損以及軟骨缺損是臨床上的常見病，骨組織工程的實驗研究為臨床上的骨缺損及軟骨缺損的治療提供了新的思路，骨髓源性干細胞具有較強的自我更新能力及很好的可塑性，可以向成骨細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、少突樹突細胞、肌細胞等細胞分化，但骨髓源性干細胞在人體的存在數(shù)量有限，取材時對患者造成的痛苦較大，成本也較高，一時間成為骨組織工程修復(fù)骨缺損及軟骨缺損發(fā)展的瓶頸。2001年ZUK等1人在人體的脂肪懸液中分離出了干細胞，這些脂肪源性干細胞23和骨髓源性干細胞具有相似的生物學(xué)特性，同樣可以向成骨細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、少突樹突細胞、肌細胞等細胞分化，況且脂肪源性干細胞來源廣泛、取材較容易、對患者造成的痛苦也較小，可以作為修復(fù)骨缺損、軟骨缺損理想的種子細胞，成為近年來研究的熱點。目的1分離兔脂肪源性干細胞。2研究脂肪源性干細胞最佳的生長條件及生物學(xué)特性。3經(jīng)流式細胞儀檢測脂肪源性干細胞CD29、CD34、CD44、CD45的陽性率。4繪制脂肪源性干細胞的細胞生長曲線。5研究兔脂肪源性干細胞在成骨誘導(dǎo)條件下的成骨誘導(dǎo)潛能，并用GOMI萘酚磷酸酯法染色及VONKOSSA染色，檢驗成骨誘導(dǎo)結(jié)果。6研究兔脂肪源性干細胞在成軟骨誘導(dǎo)條件下的成軟骨誘導(dǎo)潛能4，并用阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，檢驗成軟骨誘導(dǎo)結(jié)果。7篩選成軟骨分化相關(guān)的MIRNA，分析成軟骨分化過程中相關(guān)的MIRNA在脂肪源性干細胞成軟骨分化過程中的表達模式。方法1脂肪源性干細胞的分離用水合氯醛對兔行腹腔注射麻醉，備皮、消毒、鋪巾，無菌操作下沿腹部中線旁2CM處剪開約5CM大小切口，暴露其皮下白色脂肪組織，剪去表層筋膜及小血管，用PBS緩沖液洗滌，移入安瓿瓶，在超凈工作臺中用眼科剪剪碎成糊狀，加入2倍體積01％I型膠原酶，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱消化60MIN，消化完成后加入等體積含10％胎牛血清的DMEMF12終止消化，200目篩網(wǎng)過濾，1000RMIN離心10MIN，去上清，加入含10％FBS的DMEMF12培養(yǎng)液，輕柔吹打均勻，接種于25CM2的培養(yǎng)瓶中，置入37℃，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3D換液1次，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長，待細胞融合約80％時去除培養(yǎng)液，加入適量025％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。2脂肪源性干細胞流式細胞儀檢測用胰酶消化法收集第5代脂肪間充質(zhì)干細胞，調(diào)整密度為109L取CD29PE，CD34PE，CD44PE，CD45PE單克隆抗體各5UL，細胞懸液100ΜL，混勻后避光孵育15MIN，加PBS500ΜL重懸，流式細胞儀檢測。3繪制細胞生長曲線取第3、5、10、15代ADSCS，密度調(diào)整為1107個L，接種于96孔板，每孔200ΜL，各代4個復(fù)孔。每日取1板，每孔加入5GLMTT20ΜL，37℃孵育5H，加DMSO150ΜL，輕輕震蕩10MIN，酶標(biāo)儀490NM波長處測吸光度A值，連測9D，以細胞吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，時間D為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。4脂肪源性干細胞成骨誘導(dǎo)分化當(dāng)原代細胞傳代至第3代并覆蓋瓶底約80％時，消化瓶底細胞并收集，接種于6孔板中，3孔為實驗組，剩余3孔為對照組，24H后更換為含DMEMF12，10％FBS，01ΜMOLL地塞米松，50ΜGML抗壞血酸，10MMOLLΒ甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)液，對照組加入普通培養(yǎng)液，誘導(dǎo)2周后取細胞爬片進行GOMI萘酚磷酸酯法與VONKOSSA染色，定期倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍攝記錄。5脂肪源性干細胞成軟骨誘導(dǎo)分化當(dāng)脂肪源性干細胞的原代細胞傳至第3代并覆蓋瓶底約80％時，消化瓶底細胞并收集，接種于6孔板中，3孔為實驗組，剩余3孔為對照組，24H后更換為含DMEMF12，01ΜMOLL地塞米松，50ΜGML維生素C，10NGMLTGFΒ1，625ΜGML胰島素，625ΜGML轉(zhuǎn)鐵蛋白成軟骨誘導(dǎo)液，對照組加入普通培養(yǎng)液，誘導(dǎo)2周后取細胞爬片行阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，定期倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍攝記錄。6基因芯片篩選成軟骨相關(guān)MIRNA從兔腹部皮下脂肪組織中分離、培養(yǎng)脂肪源性干細胞。應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選脂肪源性干細胞成軟骨誘導(dǎo)前后表達差異顯著的MIRNA，采用RTPCR技術(shù)檢測差異顯著的MIRNA，在成軟骨誘導(dǎo)第7天、第14天、第21天上調(diào)和下調(diào)相對表達強度，以ELISA試劑盒檢測相應(yīng)時間點成軟骨相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果1脂肪源性干細胞形態(tài)學(xué)觀察6H后原代細胞大部分貼壁，呈圓形、短梭形或多角形，分布均勻，至36H大部分細胞成長梭形，細胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)有明顯顆粒，72H后換液繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天達80％融合，用胰蛋白酶傳代培養(yǎng)，24H后呈纖維樣形態(tài)，漩渦狀、輻射狀或平行樣排列，分布均勻，3～4D達80％融合。隨傳代次數(shù)增加，細胞形態(tài)無明顯改變，傳代細胞較原代細胞明顯增大。2脂肪源性干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果流式細胞儀檢測結(jié)果顯示不同代數(shù)細胞表型檢測結(jié)果CD29、CD44均高表達，陽性率均在95％以上，且隨代數(shù)增加而無明顯下降趨勢，CD34、CD45呈低表達，陽性率均低于5％。3脂肪源性干細胞生長曲線結(jié)果顯示第3、5、10、15代脂肪間充質(zhì)干細胞的生長曲線無明顯差異，均成“S”形，約4天進入對數(shù)生長期，約6天達峰值，隨代數(shù)增加生長曲線無明顯變化。4脂肪源性干細胞成骨誘導(dǎo)分化鑒定取第2、4、6、8代細胞用成骨誘導(dǎo)液分化后分別用GOMI萘酚磷酸酯法染色ALP染色、VONKOSSA染色。隨誘導(dǎo)時間延長，ALP染色表現(xiàn)為堿性磷酸酶陽性的細胞逐漸增多，多表現(xiàn)為棕褐色顆粒，VONKOSSA法礦化結(jié)節(jié)染色見鈣結(jié)節(jié)呈黑色，表現(xiàn)為VONKOSSA陽性，而加入普通培養(yǎng)基的對照組均為陰性表現(xiàn)。5脂肪源性干細胞成軟骨誘導(dǎo)分化鑒定取第2、4、6、8代細胞用成軟骨誘導(dǎo)液分化后分別用阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，隨誘導(dǎo)時間延長，阿利新蘭染色后誘導(dǎo)細胞成藍色，呈阿利新蘭染色陽性番紅花亮綠染色后誘導(dǎo)細胞成紅色，無綠色，呈番紅花亮綠染色陽性。6成軟骨誘導(dǎo)前后MIRNA基因芯片篩選結(jié)果脂肪源性干細胞在傳至第4代后可獲得均一性較高的脂肪源性干細胞基因芯片技術(shù)篩選出成軟骨分化前后表達差異明顯的10個MIRNA，其中6個上調(diào)，4個下調(diào)成軟骨相關(guān)蛋白Ⅱ型膠原、X型膠原、AGGRECAN的質(zhì)量濃度在成軟骨分化第7天明顯升高，第14天達峰值，第21天略有下降。結(jié)論脂肪源性干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果顯示不同代數(shù)細胞表型檢測結(jié)果CD29、CD44均高表達，陽性率均在90％以上，且隨代數(shù)增加而無明顯下降趨勢，CD34、CD45呈低表達，陽性率均低于10％，其中CD29在血管發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，CD44在新生細胞外基質(zhì)生成過程中起重要作用，這種檢測結(jié)果和骨髓源性干細胞的檢測結(jié)果一致，說明在細胞表面分子表達上脂肪源性干細胞和骨髓源性干細胞具有很相似的共性。繪制生長曲線，結(jié)果顯示第3、5、10、15代脂肪源性干細胞的生長曲線無明顯差異，均成“S”形，約4天進入對數(shù)生長期，約6天達峰值，隨代數(shù)增加生長曲線無明顯變化，說明脂肪源性干細胞的增值特點較穩(wěn)定，可多次重復(fù)利用。6H后原代細胞大部分貼壁，呈圓形、短梭形或多角形，分布均勻，至36H大部分細胞成長梭形，細胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)有明顯顆粒，72H后換液繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天達80％融合，用胰蛋白酶傳代培養(yǎng)，24H后呈纖維樣形態(tài)，漩渦狀、輻射狀或平行樣排列，分布均勻，3～4D達80％融合。隨傳代次數(shù)增加，細胞形態(tài)無明顯改變，傳代細胞較原代細胞明顯增大，多次培養(yǎng)的脂肪源性干細胞生物學(xué)特性較穩(wěn)定，易于分離和培養(yǎng)，經(jīng)液氮冷凍保存及復(fù)蘇后，生物學(xué)特性無明顯變化。本實驗證明了脂肪源性干細胞在誘導(dǎo)條件下具有向成骨分化的潛能，傳代后各項生物特性指標(biāo)無明顯下降，生物性能穩(wěn)定，切取材方便、創(chuàng)傷小，可作為修復(fù)骨缺損的理想的種子細胞。脂肪源性干細胞在成軟骨誘導(dǎo)條件下，分別用阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，均呈陽性表達，有酸性粘多糖的分泌，而軟骨細胞的主要功能就是分泌酸性粘多糖和膠原蛋白，本實驗隨時間的延長，染色結(jié)果有加重的趨勢，分泌酸性粘多糖和膠原蛋白的含量有增加的趨勢，證明了脂肪源性干細胞在成軟骨誘導(dǎo)條件下具有成軟骨分化的潛能，可以作為修復(fù)軟骨缺損的理想種子細胞。

簡介：目的以大段骨缺損性骨不連病人為研究對象，應(yīng)用鑲嵌式骨外固定器行一期骨延長術(shù)治療骨不連，評價應(yīng)用鑲嵌式骨外固定器行骨延長術(shù)治療大段骨缺損性骨不連的臨床療效，為臨床選擇合理治療方法提供理論依據(jù)。方法回顧性研究2000年10月2008年6月應(yīng)用鑲嵌式骨外固定器行一期骨延長治療的大段骨缺損性骨不連43例，男24例，女19例，年齡34～57歲，平均318歲；其中股骨16例，脛骨12例，肱骨7例，尺橈骨8例；骨缺損長度3526CM，平均78CM。分別根據(jù)其恢復(fù)時間、骨折愈合結(jié)果、功能恢復(fù)結(jié)果、骨延長愈合速度進行評價。結(jié)果43例病人術(shù)后隨診9～58個月，平均254個月，42例骨缺損達到骨性愈合，影像學(xué)愈合時間6～33個月，平均1413個月；患者肢體完全承重并自由行走時間4～25個月，平均131個月。骨外固定器取除時間6～34個月，平均18個月。骨不連愈合結(jié)果優(yōu)良率907％，功能恢復(fù)結(jié)果優(yōu)良率967％，骨延長愈合速度為295DAYSCM～426DAYSCM，平均為346DAYSCM。結(jié)論利用鑲嵌式骨外固定器一期骨延長在恢復(fù)時間、骨折愈合結(jié)果、功能恢復(fù)結(jié)果、骨延長愈合速度評價中均有良好療效，是治療大段骨缺損性骨不連的有效方法，在修復(fù)長節(jié)段的骨缺損性骨不連中具有一定的優(yōu)勢。

簡介：目前人工膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)中使用的大多數(shù)假體是根據(jù)膝關(guān)節(jié)醫(yī)學(xué)解剖所獲得的幾何外型尺寸以及假體的手術(shù)后穩(wěn)定性與運動特性進行設(shè)計的。因此膝關(guān)節(jié)骨幾何學(xué)與形態(tài)學(xué)的研究是假體設(shè)計工作的基礎(chǔ)內(nèi)容。測量截骨前后膝關(guān)節(jié)股骨遠端、脛骨近端的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)是設(shè)計出符合亞洲人群膝關(guān)節(jié)的解剖型人工假體的一個重要方向。本論文利用數(shù)字化和CT掃描技術(shù)對正常膝關(guān)節(jié)截骨前后股骨遠端、脛骨近端各特征參數(shù)進行了測量和研究建立了膝關(guān)節(jié)數(shù)字模型數(shù)據(jù)庫探討了各參數(shù)相互關(guān)系以及歸一化標(biāo)準(zhǔn)化了膝關(guān)節(jié)數(shù)據(jù)并以此為設(shè)計依據(jù)結(jié)合良好的假體設(shè)計理念和方法設(shè)計出適合的膝關(guān)節(jié)假體。首先利用CT掃描及三維重建技術(shù)獲得膝關(guān)節(jié)股骨和脛骨三維模型及形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析了膝關(guān)節(jié)的解剖形態(tài)為制作膝關(guān)節(jié)假體提供了一定的數(shù)據(jù)依據(jù)。通過對正常膝關(guān)節(jié)進行CT掃描應(yīng)用MIMICS1001進行膝關(guān)節(jié)三維重建定位、模擬截骨脛骨近端測量股骨遠端、脛骨近端各參數(shù)結(jié)果用統(tǒng)計軟件IBMSPSSSTATISTICS190統(tǒng)計學(xué)分析處理最終建立了膝關(guān)節(jié)數(shù)字模型數(shù)據(jù)庫探索了膝關(guān)節(jié)各特征參數(shù)的相互關(guān)系為膝關(guān)節(jié)假體設(shè)計提供了形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)?；诠切螒B(tài)學(xué)的研究考慮膝關(guān)節(jié)的運動學(xué)特性膝關(guān)節(jié)的主要特征參數(shù)影響人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的關(guān)鍵因素以及良好的假體設(shè)計理念和方法使用PROE進行膝關(guān)節(jié)假體結(jié)構(gòu)設(shè)計完成了股骨組件、脛骨平臺組件及脛骨平臺襯墊的結(jié)構(gòu)設(shè)計?；谏鲜黾袤w結(jié)構(gòu)設(shè)計的結(jié)果應(yīng)用ANSYSWKBENCH140對膝關(guān)節(jié)假體結(jié)構(gòu)模型進行仿真靜力學(xué)分析分析不同屈膝角度下的假體模型應(yīng)力應(yīng)變情況并完成假體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化并且探索出假體設(shè)計的一種良好方法。

簡介：目的探討2型糖尿病非胰島素治療患者跟骨骨質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變，及跟骨HRCT圖像數(shù)字分析的臨床應(yīng)用價值。方法研究對象32例男性，年齡50～60歲，其中糖尿病組16例，非糖尿病組16例。兩組均經(jīng)雙能X線骨密度儀DXA檢查及64排螺旋CTMSCT掃描獲取高分辨CTHRCT圖像進行分析，得出跟骨骨密度BMD及骨小梁表觀結(jié)構(gòu)參數(shù)，應(yīng)用獨立樣本T檢驗顯示兩組差異的顯著性及PERSON積差相關(guān)分析二者關(guān)系。結(jié)果9個參數(shù)在糖尿病組與非糖尿病組中顯示了不同的差異性病例組BMD低于對照組；中央三角區(qū)的骨小梁表觀結(jié)構(gòu)參數(shù)，TBRA病例組低于對照組、BMRA病例組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；應(yīng)力性骨小梁后組表觀結(jié)構(gòu)參數(shù)均未顯示差異性。中央三角區(qū)骨小梁表觀結(jié)構(gòu)參數(shù)TBRA與BMD正相關(guān)、BMRA、EN與BMD負相關(guān)。結(jié)論2型糖尿病非胰島素治療患者跟骨骨密度與中央三角區(qū)部分結(jié)構(gòu)參數(shù)在病例組與對照組間可見差異，跟骨HRCT圖像分析能客觀顯示骨質(zhì)改變。

簡介：骨骼肌組織起源于中胚層，成體骨骼肌組織由終末分化的多核肌纖維和幾種單個核細胞群組成，其中單個核細胞群體被認為是骨骼肌組織中處于原始分化狀態(tài)的干細胞。這些骨骼肌干細胞在體內(nèi)多數(shù)情況下呈一種靜息狀態(tài)，當(dāng)肌肉受到各種損傷因素等刺激時被激活，大量增殖、融合，分化形成新的成熟的骨骼肌細胞，從而修復(fù)受損組織。這些細胞在體外培養(yǎng)基和營養(yǎng)因子的作用下，也可被激活并大量增殖，此時體外培養(yǎng)的激活的骨骼肌干細胞被稱為成肌細胞。一些研究已經(jīng)表明，骨骼肌干細胞同其他組織的干細胞同樣具有潛在的多向分化能力，它們除了向骨骼肌組織分化以外，還可在特定條件下多潛能分化形成中胚層來源的成骨組織、脂肪樣細胞、間質(zhì)細胞，并可跨越胚層譜系的限制向神經(jīng)外胚層轉(zhuǎn)化，從而可被用來做為細胞來源，進行神經(jīng)系統(tǒng)疾病的移植治療。本研究通過聯(lián)合應(yīng)用特殊培養(yǎng)基和細胞因子，體外誘導(dǎo)骨骼肌組織來源的干細胞即成肌細胞向神經(jīng)外胚層的原始細胞神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化，并進一步向神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化；同時與成肌細胞系和非肌肉組織的細胞系進行比較，證明誘導(dǎo)條件對原代培養(yǎng)的成肌細胞具向神經(jīng)外胚層的轉(zhuǎn)化具有特異性。實驗結(jié)果提示骨骼肌來源的干細胞有可能作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病的一種新的干細胞來源。

簡介：本課題前期實驗已證實皮質(zhì)骨來源的成骨細胞成分更純，表型更穩(wěn)定，且可采取連續(xù)植塊培養(yǎng)法獲取大量成骨細胞；同時體外生物相容性試驗證實自制小牛異種脫蛋白骨下文統(tǒng)稱異種脫蛋白骨具有良好的生物相容性。本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，以皮質(zhì)骨來源成骨細胞為種子細胞，以異種脫蛋白骨為支架材料，體外構(gòu)建組織工程骨，作為自體骨替代材料行修復(fù)兔四肢骨缺損的實驗。本文包括以下內(nèi)容目的探討異種脫蛋白骨DEPROTEINIZEDBONE，DPB復(fù)合皮質(zhì)骨來源成骨細胞修復(fù)兔橈骨臨界骨缺損的效果。方法48只成年雌性新西蘭大白兔的一側(cè)橈骨均建立15CM的臨界骨缺損模型，隨機分為A，B，C，D四組A組植入已經(jīng)在體外共同培養(yǎng)7天的異種脫蛋白骨與成骨細胞的復(fù)合材料；B組植入自體髂骨；C組植入單純異種脫蛋白骨材料；D組作為空白對照組。術(shù)后進行以下檢測1X線觀察術(shù)后4、8、12周、2血液C反應(yīng)蛋白檢測術(shù)后1天、3天、1周、2周、3標(biāo)本大體觀察術(shù)后12周、4骨密度測量術(shù)后12周、5生物力學(xué)測試術(shù)后12周、6組織形態(tài)學(xué)觀察術(shù)后12周。通過以上指標(biāo)綜合評價各實驗組骨缺損的修復(fù)效果。結(jié)果1X線顯示術(shù)后4周，A組有散在的密度增高影；B組自體骨吸收明顯，斷端增殖明顯；C組橈骨斷端明顯。術(shù)后8周，A組支架材料與橈骨兩斷端基本融合，支架材料所在區(qū)域密度不均；B組橈骨兩斷端基本融合，骨缺損區(qū)仍有部分沒有完全修復(fù)；C組支架材料有密度增高影，橈骨斷端沒有愈合。術(shù)后12周A組植入材料已經(jīng)與橈骨兩斷端融為一體，骨折線消失并開始重塑。B組自體骨移植的髂骨與橈骨兩斷端基本融合，塑形完成。C組可見少量骨形成，材料明顯吸收，但骨折線沒有消失。D組骨缺損未修復(fù)。2C反應(yīng)蛋白測試顯示各實驗組動物術(shù)后CRP均有升高，并隨時間逐漸降低，各組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3術(shù)后12周標(biāo)本大體觀察顯示A、B組植入體與橈骨兩斷端愈合牢固；C組支架材料只有部分降解，橈骨斷端界限清晰；D組骨缺損明顯，由軟組織填充。4術(shù)后12周骨密度測量及新骨生成均顯示A組數(shù)據(jù)低于B組，但明顯高于C組P＜005。5術(shù)后12周生物力學(xué)測試顯示A組的最大抗折載荷明顯高于C組P＜005，且接近于B組數(shù)據(jù)。6術(shù)后12周組織學(xué)觀察顯示A組骨缺損區(qū)大量新生骨生成，B組已經(jīng)基本實現(xiàn)髓腔再通，C組僅有少量新生骨形成，DPB微孔間充滿纖維結(jié)締組織，D組僅見纖維結(jié)締組織。結(jié)論皮質(zhì)骨來源成骨細胞復(fù)合異種脫蛋白骨可以安全高效修復(fù)兔橈骨臨界骨缺損。

簡介：由于先天性的和創(chuàng)傷性的原因，我國有大量的骨缺損患者，這其中不少患者屬于大塊骨缺損，靠自身能力不能完全修復(fù)，需要植入骨修復(fù)材料。因此，構(gòu)建具有優(yōu)異骨修復(fù)功能的骨修復(fù)替代材料不僅完全必要，而且十分迫切的。為此，我們選用一種新型促進成骨化合物并復(fù)合于合適的載體構(gòu)建新型骨修復(fù)材料并對其骨修復(fù)性能進行評價。當(dāng)前在促進骨修復(fù)的眾多細胞因子研究中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白BONEMPHOGEICPROTEINS，BMPS最具代表性。然而，在應(yīng)用方面，BMPS作為活性蛋白分子，由于植入部位存在易分解、易丟失、作用短效、異體種蛋白排斥反應(yīng)等局限，直至目前仍無商品化的、效果可靠的骨誘導(dǎo)因子可供臨床選擇。即使目前現(xiàn)有的實驗用BMPS，價格也十分昂貴。鑒于此，研究者一直尋找具有骨修復(fù)作用的新的化合物，去鐵敏DESFERRIOXAMINE，DFO是我們最近篩選出來的具有強大促進骨修復(fù)作用的化合物。其主要作用機制是抑制低氧誘導(dǎo)因子HYPOXIAINDUCIBLEFACT1Α，HIF1Α的降解，而HIF1Α通過誘導(dǎo)促血管生成因子表達，促進骨折愈合過程中血管生成。同時HIF1Α還參與對骨系細胞功能的調(diào)控促進骨形成。我們從7種抑制HIF降解的小分子化合物中篩選出成骨性能最強的DFO，我們體外實驗證實DFO在U20SHRELUC細胞中，可上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子反應(yīng)元件HRE的表達，在基質(zhì)干細胞中MSCS中可升高HIF1Α水平，促進VEGF表達，胎鼠跖骨體外培養(yǎng)中，周圍有大量血管生成。前期已有動物實驗證實，在牽張成骨和骨折愈合的動物模型中局部應(yīng)用DFO科取得滿意的修復(fù)效果。骨修復(fù)材料的構(gòu)建還需要合適的載體，在前期研究的基礎(chǔ)上，我們選擇煅燒骨TRUEBONECERAMIC，TBC作為載體，與其它載體材料相比，TBC有如下優(yōu)點保持了自然松質(zhì)骨的海綿狀結(jié)構(gòu)，且具有很好的空隙率；由骨礦物質(zhì)結(jié)晶組成，鈣磷比接近正常骨；良好生物相容性和骨傳導(dǎo)性。我們摸索出合適的濃度的DFO復(fù)合于TBC構(gòu)建生物活性新型組織工程化骨DFOTBC，對DFO的釋放速度和骨修復(fù)性能進行研究。針對這種材料設(shè)計，我們進行了以下5個實驗研究。一、TBC作為骨移植材料的相關(guān)研究探索制備一種新的植骨材料一鍛燒牛松質(zhì)骨，并研究其理化性能和生物相容性。方法將新鮮小牛骨制成條狀，經(jīng)煮沸及在氫氧化鈉、雙氧水中浸泡初步脫脂脫蛋白，干燥后入鍛燒爐緩慢鍛燒爐，即制得鍛燒牛松質(zhì)骨。用液體靜力承重法測定氣孔率，掃描電鏡測定孔徑，材料測試機測抗壓抗折強度，X線衍射測材料成分。通過溶血試驗、微核試驗、全身急性毒性試驗、局部刺激試驗、熱源檢測試驗、體內(nèi)植入試驗等了解材料的生物相容性。結(jié)果顯示電鏡下材料微孔互相交通，孔徑250450ΜM，孔隙率約為76％，X線衍射分析表明鈣磷約比175，接近正常骨，抗壓和抗折載荷分別為834±106N和89297N。材料溶血率為0521％，在允許范圍，微核試驗陰性，全身急性毒性試驗結(jié)果無異常，局部刺激試驗注射部位無水腫紅斑出現(xiàn)、熱源檢測試驗結(jié)果符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。研究表明鍛燒牛松質(zhì)骨具有一定的強度，合適的孔徑，微孔互相交通，有可靠的生物安全性，可作為植骨材料，用于臨床。二、TBC對DFO緩釋作用的體外實驗研究為了研究TBC作為緩釋載體對DFO的體外緩釋作用，探討DFOTBC復(fù)合物的藥物釋放動力學(xué)，將DFO以I125標(biāo)記，以單純TBC為對照組，以按TBC配比2倍體積5MMDFO的配比將TBC與DFO復(fù)合作為實驗組。將DFOTBC樣條浸入001MOLL的磷酸鹽緩沖液中，分別在第1，2，3，4，5，6，7，14，30，60天取緩釋液，用GAMMA計數(shù)儀分析不同時間的標(biāo)本中的DFO緩釋量，繪制DFO緩釋曲線，總結(jié)藥物釋放動力學(xué)規(guī)律。結(jié)果顯示第1～14天，DFO出現(xiàn)快速釋放，釋放曲線呈快速上升直線。第14～30天，DFO釋放處于平臺期，釋放曲線接近一水平直線。第30～60天DFO出現(xiàn)緩慢而持久的釋放，釋放曲線表現(xiàn)為上升之曲線DFO的50％釋放時間為105天，其1，3，5，7，14，30和60天的釋放率為771％，1919％，2637％，3467％，6720％，8599％和9999％。提示TBC能對DFO有緩慢而持久的體外緩釋作用，有望充當(dāng)DFO的緩釋載體，但緩釋速度尚有待提高。三、TBC對DFO的緩釋作用的體內(nèi)實驗研究為了研究TBC作為緩釋載體對DFO的體內(nèi)緩釋作用，探討DFOTBC復(fù)合物在體內(nèi)緩釋DFO的藥物釋放動力學(xué)，將DFO以I125標(biāo)記，以單純TBC為對照組，以按TBC配比2倍體積5MMDFO的配比將TBC與DFO復(fù)合作為實驗組。將DFOTBC樣條經(jīng)過手術(shù)置入兔的右側(cè)橈骨中段內(nèi)，分別在第1，2，3，4，5，6，7，14，30和60天手術(shù)取材，用GAMMA計數(shù)儀分析不同時間的標(biāo)本中的DFO殘留量，計算出DFO緩釋量，繪制DFO緩釋曲線，總結(jié)藥物釋放動力學(xué)規(guī)律，并與體外緩釋實驗結(jié)果比較。結(jié)果顯示第1～14天DFO出現(xiàn)快速釋放，釋放曲線呈快速上升直線。第14～30天DFO釋放處于平臺期，釋放曲線接近一水平直線。第30～60天DFO出現(xiàn)緩慢而持久的釋放，釋放曲線表現(xiàn)為上升支曲線。DFO的50％釋放時間為95天，其第1，3，5，7，14，30和60天釋放量分別是817％、2018％，2700％，3668％，7032％，8809％和9999％。提示TBC能對DFO有緩慢而持久的體內(nèi)緩釋作用，且緩釋速度較體外有較大增快，有望充當(dāng)DFO的緩釋載體。四、DFOTBC的肌肉植入實驗研究為了研究DFOTBC植入動物體的成骨生物學(xué)行為，為進一步進行DFOTBC用于骨填充的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和方法積累，按TBC配比2倍體積5MMDFO的比例將TBC與DFO復(fù)合成DFOTBC，經(jīng)手術(shù)植入于昆明小鼠臀部肌肉袋中。定期取材進行大體觀察、組織切片，觀察材料表面變化、周圍組織有無感染等不良反應(yīng)、有無骨形成和生物力學(xué)指標(biāo)最大抗壓強度的改變。結(jié)果顯示植入后的TBC在體內(nèi)逐漸出現(xiàn)降解，60天時非常明顯。組織切片發(fā)現(xiàn)無新骨生成，最大抗壓強度持續(xù)減低。DFOTBC植入后可見大量新骨形成，最大抗壓強度持續(xù)升高，60天時升高13204％。提示DFOTBC植入小鼠肌肉內(nèi)未見感染等不良反應(yīng)，可見骨形成，生物力學(xué)強度升高，有較好的連續(xù)性。五、DFOTBC修復(fù)大塊骨缺損的實驗研究為了研究DFOTBC植入動物骨內(nèi)DFOTBC的降解和新骨替代行為，為將DFOTBC用于骨填充的研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，按TBC配比2倍體積5MMDFO的配比將TBC與DFO復(fù)合成DFOTBC，經(jīng)手術(shù)植入于兔橈骨中段臨界性骨缺損中。術(shù)后定期取材進行大體觀察、X線片和組織切片，觀察材料降解和被新骨替代的速度。結(jié)果顯示植入后的DFOTBC在體內(nèi)降解和被新骨替代較單純TBC明顯加快，DFOTBC植入后30天時X線片影像邊緣明顯不清，有骨痂樣影，60天時輪廓幾近消失。TBC植入后30天密度減低，但仍然外形清楚。組織切片顯示60天后DFOTBC中間大量新骨形成，而TBC在60天后的降解和被新骨替代只有相當(dāng)于DFOTBC在30天以內(nèi)的水平。提示DFOTBC植入兔橈骨中段缺損后，其材料降解和被新骨替代明顯加快，且二者始終結(jié)合緊密。DFOTBC是較單純TBC有明顯改進的新型生物活性骨修復(fù)材料?？偨Y(jié)以上實驗結(jié)果，可以得知TBC有較好的生物力學(xué)強度、微孔結(jié)構(gòu)等理化性能。TBC在體外和體內(nèi)均有DFO的多孔緩釋載體的特性，且在體內(nèi)的緩釋速度較體外明顯加快；DFOTBC植入小鼠肌肉內(nèi)能誘導(dǎo)骨形成，在修復(fù)骨缺損試驗中能明顯加快新骨的生成、長入和材料的降解。DFOTBC有望成為一種性能明顯優(yōu)于TBC的生物活性骨修復(fù)材料，用于對骨缺損等骨科病損的臨床修復(fù)。

簡介：點擊查看更多低強度超聲對兔脛骨骨延長動物模型骨折愈合的影響.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的觀察阿膠強骨口服液對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響及機制，并探討阿膠強骨口服液對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療作用。方法1六月齡雌性SD大鼠16只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為二組假手術(shù)組和去卵巢組，每組8只。3個月后取材檢測兩側(cè)股骨，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)；使用雙能X線骨密度儀測量大鼠股骨頭及粗隆部BMD；生物力學(xué)測定儀上測定最大載荷和最大壓應(yīng)變。26月齡SD大鼠36只，隨機分為A組，B組，C組，每組12只。6個月后取材檢測。采用ELISA法對去卵巢大鼠血清25OHVD3和125OH2VD3進行研究，用熒光定量PCR對腎臟VDR基因進行定量分析。36月齡SD大鼠36只，隨機分為A組，B組，C組，每組12只。6個月后取材檢測。采用熒光定量PCR對I型膠原基因進行定量分析，采用免疫印跡法對I型膠原蛋白進行分析。4六月齡雌性SD大鼠16只，其中12只用于灌胃制備含藥血清和對照血清，4只用于提取細胞。將細胞分為兩組，即含藥血清組和對照血清組。M組的細胞用含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，C組的細胞用對照血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩組中均加入25NGUL的MCSF和RANKL各1UL。分別取干預(yù)一周的兩組細胞進行TRAP染色。采用噻唑鹽比色法測增殖情況。通過ANNEXINV聯(lián)合PI試劑盒采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果1造模情況1假手術(shù)組大鼠股骨骨小梁豐富、連續(xù)、致密；去卵巢組大鼠骨小梁排列稀疏、部分斷裂、骨小梁平均寬度變小、骨小梁間距增大。平均骨小梁寬度假手術(shù)組為7123±1062，去卵巢組為5265±1217，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異；平均骨小梁間距假手術(shù)組為8368±369，去卵巢組為10532±355，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異；2假手術(shù)組和去卵巢組大鼠股骨頭生物力學(xué)結(jié)果最大壓應(yīng)力假手術(shù)組為34587±3216，去卵巢組為26613±3005，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異；最大載荷假手術(shù)組為3913±428，去卵巢組為3239±437，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異；3股骨頭骨密度假手術(shù)組為0316±0015，去卵巢組為0281±0017，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。2C組血液中25羥基維他命D3濃度和1，25羥基維他命D3濃度與B組比較明顯增高，其中對25羥基維他命D3濃度增高尤為明顯，已接近A組，差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。B組與C組相比，說明擴增效率的差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。3C組I型膠原蛋白與B組比較明顯增高，已接近A組，差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。I型膠原基因熒光定量PCR結(jié)果B組與C組相比，說明擴增效率的差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。41破骨細胞形態(tài)學(xué)觀察破骨細胞胞漿飽滿，內(nèi)含許多空泡結(jié)構(gòu)，核大呈圓形，核仁清晰。可見少量融合細胞，含有幾個胞核，胞體大，胞漿豐富；2TRAP染色結(jié)果顯示破骨細胞胞漿陽性，呈酒紅色，核呈陰性；3阿膠強骨口服液對破骨細胞增殖率的影響OD值值分別為01825±003641和01819±003532，統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異；4阿膠強骨口服液對破骨細胞凋亡率的影響凋亡率分別為8951±162和6379±087％，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。結(jié)論1實驗SD大鼠，在摘除雙側(cè)卵巢3月后成功復(fù)制出了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。2阿膠強骨口服液可以增加去卵巢大鼠血液中25OHVD3、125OH2VD3的濃度，同時上調(diào)骨骼中VDR的表達水平。3阿膠強骨口服液可以上調(diào)骨組織Ⅰ型膠原MRNA的表達水平，同時顯著提高Ⅰ型膠原蛋白表達含量，這是阿膠強骨口服液治療骨質(zhì)疏松的機制之一。4成功使用RANKL和MCSF體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞成為破骨細胞，阿膠強骨口服液血清組與對照組對破骨細胞增殖率無顯著性差異但是阿膠強骨口服液血清組可以增加破骨細胞凋亡率。這是阿膠強骨口服液治療骨質(zhì)疏松的機制之一。

簡介：羥基磷灰石HA與聚乳酸PLA材料形成的復(fù)合材料PLAHA可以提高單純PLA的力學(xué)強度和生物相容性同時解決了普通HA抗彎強度低、脆性大、等臨床應(yīng)用中遇到的問題因此成為生物可吸收材料的研究熱點。NANOHAPDLLA復(fù)合微球除具備一般復(fù)合材料的優(yōu)點外還具有良好的三維形態(tài)和較大的比表面積可適用于三維空間培養(yǎng)工程化組織可望骨修復(fù)中得到良好的應(yīng)用。本實驗采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了納米羥基磷灰石聚乳酸NANOHAPDLLA復(fù)合微球支架材料。所制得的NANOHAPDLLA復(fù)合微球粒徑范圍在150～200ΜM表面較為粗糙適合細胞黏附、生長。FTIR和XRD檢測結(jié)果顯示微球兼具有兩種組分的性質(zhì)可望在骨修復(fù)中得到良好的應(yīng)用。本文制備了不同比例的NANOHAPDLLA復(fù)合微球通過體外降解和細胞增殖實驗對NANOHAPDLLA復(fù)合微球是否適合做為成骨支架進行了評價并確定了該支架中最適于細胞生長和骨組織修復(fù)的NANOHA含量。我們利用乳化溶劑揮發(fā)法制備出NANOHA含量分別為5％、10、15、20的NANOHAPDLLA復(fù)合微球?qū)ζ潴w外降解PH值和質(zhì)量進行研究然后將WISTAR乳鼠顱蓋骨源性成骨細胞在不同NANOHA含量的復(fù)合支架上進行體外培養(yǎng)通過MTT法測定細胞增殖曲線體外實驗結(jié)果表明20NANOHA含量NANOHAPDLLA復(fù)合微球穩(wěn)定性好成骨細胞增殖作用強具有良好的細胞相容性是一種有發(fā)展前途的骨缺損修復(fù)材料。

簡介：中國載人航天器“神州七號”的圓滿成功實現(xiàn)了中國太空行走的偉大夢想。而下一個目標(biāo)是在太空建立空間實驗室，讓科研人員長期駐守在空間實驗室內(nèi)進行科研，這就對我國航天醫(yī)學(xué)的發(fā)展提出了更加嚴峻的要求。大量研究表明，當(dāng)航天員進入空間失重環(huán)境后會出現(xiàn)失重性骨質(zhì)丟失，主要表現(xiàn)為骨量減少，骨礦度降低，糞鈣及尿鈣排出增多，血鈣升高，出現(xiàn)負鈣平衡，導(dǎo)致骨密度下降和骨質(zhì)疏松（OSTEOPOSIS），最終使骨力學(xué)性能下降，骨折風(fēng)險增高。航天觀察與地面模擬實驗結(jié)果均顯示失重或模擬失重能導(dǎo)致人和動物的持續(xù)骨質(zhì)丟失，研究表明太空飛行導(dǎo)致骨密度每個月約下降2，相當(dāng)于一個婦女絕經(jīng)后1年的骨質(zhì)丟失量。這種骨質(zhì)丟失在航天飛行中呈進行性改變，中長期飛行會嚴重影響骨骼的結(jié)構(gòu)和功能。航天活動中失重造成的骨礦鹽的持續(xù)丟失導(dǎo)致嚴重的骨質(zhì)疏松對宇航員的健康構(gòu)成了極大的威脅，成為人類長期停留太空和進行星際探索的主要障礙之一。因此，對失重狀態(tài)下骨量減少的機理研究及如何預(yù)防失重骨質(zhì)丟失一直是航天醫(yī)學(xué)研究的重點和熱點。成骨細胞是骨組織中最重要的力學(xué)感受細胞和成骨效應(yīng)細胞，目前大量研究已證實，失重和模擬失重導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失是一個以骨形成抑制起主導(dǎo)作用的過程，以成骨細胞數(shù)量下降、骨礦形成障礙和骨成熟延遲為特征。由于微重力下成骨細胞缺乏必要的機械應(yīng)力刺激，使其增殖和分化功能下降，導(dǎo)致成熟成骨細胞數(shù)量下降，骨形成減少，這是造成空間骨丟失的主要原因。而成骨細胞是由骨髓間充質(zhì)干細胞（BONEMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS）在體內(nèi)的各種調(diào)控因素的調(diào)節(jié)下發(fā)展而來。骨形成包括BMSCS分化為成骨細胞和成骨細胞成熟為骨細胞兩個過程。因此深入研究成骨細胞以及BMSCS在失重性骨質(zhì)丟失中的作用具有非常重要的意義。目前關(guān)于失重性骨質(zhì)丟失的研究焦點和熱點主要是成骨細胞對微重力的響應(yīng)、信號傳導(dǎo)、基因表達和功能變化及微重力對成骨細胞整個分化過程的影響。關(guān)于微重力對BMSCS超微結(jié)構(gòu)的影響報道甚少。目的1觀察在一定誘導(dǎo)條件下，體外分離培養(yǎng)的大鼠BMSCS向成骨細胞的定向分化情況。熟悉并掌握細胞培養(yǎng)技術(shù)，為下一步實驗奠定基礎(chǔ)。2探討模擬微重力對大鼠BMSCS成骨分化過程中堿性磷酸酶（ALP）活性及細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。方法1大鼠BMSCS向成骨細胞的定向分化的驗證采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離大鼠BMSCS，將分離純化的大鼠BMSCS傳代培養(yǎng)后隨機分成2組，實驗組用含抗壞血酸、Β甘油磷酸鈉和地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組用未含誘導(dǎo)液的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。2使用旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）中50ML容積的高截面縱橫比容器（HIGHASPECTRATIOVESSEL，HARV）模擬微重力，并結(jié)合CYTODEX3微載體進行大鼠BMSCS成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察模擬微重力狀態(tài)下大鼠BMSCS定向成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶（ALP）活性及細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果1、原代大鼠BMSCS接種后4D，可觀察到成纖維細胞樣的細胞集落，9至12D長滿單層培養(yǎng)瓶底，傳代細胞4至7D長滿單層；大鼠BMSCS向成骨細胞定向誘導(dǎo)10天后，誘導(dǎo)組大鼠BMSCSALP活性（13016±2423）明顯高于對照組ALP活性（0675±0103），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0002）。連續(xù)成骨誘導(dǎo)20D后，可見多個散在分布的圓形不透明鈣化結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后礦化結(jié)節(jié)呈紅色，而對照組細胞融合成片，未見礦化結(jié)節(jié)沉積。說明在一定誘導(dǎo)條件下大鼠BMSCS能向成骨細胞定向分化。2、RCCS中模擬微重力狀態(tài)下經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10天后大鼠BMSCSALP活性（0724±0089）明顯低于正常重力對照組ALP活性（13167±2550），差異有統(tǒng)計學(xué)意義P0002。模擬微重力組透射電鏡下可見部分細胞出現(xiàn)凋亡的細胞學(xué)形態(tài)改變，部分細胞核呈不規(guī)則形，有12個核仁，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的細胞器，未見細胞膠原纖維以及鈣化基質(zhì)。對照組細胞胞漿豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基器發(fā)達，核漿比例小，存在異染色質(zhì)，明顯具有成熟細胞的表現(xiàn)；細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)排列規(guī)律的膠原纖維以及初期的鈣化、成熟的鈣化基質(zhì)等幾種狀態(tài)，外基質(zhì)中出現(xiàn)排列規(guī)律的膠原纖維以及初期的鈣化、成熟的鈣化基質(zhì)等幾種狀態(tài)。說明模擬微重力能誘導(dǎo)大鼠BMSCS的凋亡并抑制其向成骨細胞的分化。結(jié)論1、分離純化的大鼠BMSCS在一定條件下能向成骨細胞定向分化；2、模擬微重力狀態(tài)下能誘導(dǎo)大鼠BMSCS的凋亡并抑制其向成骨細胞的分化。

簡介：論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名論文評閱人1昌賓』教授』浙江蟲醫(yī)藥太堂隘屬箍二醫(yī)院評閱人2杜勤』主任醫(yī)垣』逝江太堂醫(yī)堂院隘屆籠三醫(yī)院評閱人3塞丞良廈I研究員』浙江太堂醫(yī)堂院附屬箍三醫(yī)院答辯委員會主席廈查名』教援』浙江太堂醫(yī)堂院附屬筮二醫(yī)院委員L陳建丞』主任醫(yī)婭』杭劃直紅會醫(yī)院委員2陳焰』主任醫(yī)婭』浙江太堂醫(yī)堂院附屬箍三醫(yī)院委員3王髭花』主任醫(yī)啞』浙江太堂醫(yī)堂院附屬箍三醫(yī)院委員4王良敖』主任醫(yī)亟』浙江太堂醫(yī)堂院附屬箍三醫(yī)院委員5浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文致謝致謝不知不覺中，美好的七年大學(xué)時光就這樣過去了。忙碌的學(xué)習(xí)工作生活中突然意識到自己即將離開親愛的母校、老師和同學(xué)，走向社會，些許的憧憬伴隨著更多的傷感和留戀?；叵氪髮W(xué)里老師和同學(xué)在學(xué)J工作生活上的幫助和照顧，心中充滿感激。首先由衷的感謝我的導(dǎo)師毛建山老師。過去的兩年中我時刻感受著毛老師的熱情和關(guān)懷，這是所有和毛老師有接觸的同學(xué)都有切身感受的。毛老師在工作上嚴謹熱情，勤勤懇懇，總是加班加點，并且積極進取，不斷地開拓創(chuàng)新，這種精神深深影響著我和他周圍的每一個人。毛老師對待學(xué)生嚴格要求，不斷要求學(xué)生開拓視野，學(xué)J課本外的新知識。在我的畢業(yè)論文上，毛老師給了建設(shè)性的意見，并一次次給我指導(dǎo)和修改，給了極大的幫助。對于毛老師在學(xué)習(xí)、工作、生活的給予的無微不至的關(guān)懷和幫助，在此再次表示深深地感謝。感謝浙江省中醫(yī)院呂賓教授，浙二醫(yī)院杜勤主任、朱永良老師在百忙之中評閱論文并給予中肯的意見和指導(dǎo)。感謝浙二消化內(nèi)科的錢可大教授、蔡建庭主任、杜勤主任以及陳焰、潘文勝、宋震亞、王彩花、吳勤動、陸新良、王良靜、陳清宇、周海波、馬望前、韓躍華、昂健、王小英、鐘丹丹、張晗蕓、陳佳敏、張馨梅、邵黎明、許志鵬、金丹等各位老師在科室和胃鏡室學(xué)習(xí)期間給予我的指導(dǎo)，感謝師兄師姐在我臨床學(xué)J期間幫助。感謝指導(dǎo)員李智巧老師和班主任楊巍老師在大學(xué)生活的關(guān)懷和幫助。感謝我的室友王斌、柳琪、龍烈鵬，和我一起度過和諧快樂的七年大學(xué)時光。同時也深深地感謝無時無刻不在感謝的親愛的父母，感謝你們的支持和鼓勵。感謝浙大，感謝母校，美麗的校園、龐大的圖書館、安靜的教室、開闊的體育場讓大學(xué)生活豐富充實。