兔脂肪源性干細胞的生物學特性及其向成骨、成軟骨誘導分化的實驗研究.pdf

1、腫瘤、創(chuàng)傷、感染、先天性疾病、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)等導致的骨缺損以及軟骨缺損是臨床上的常見病，骨組織工程的實驗研究為臨床上的骨缺損及軟骨缺損的治療提供了新的思路，骨髓源性干細胞具有較強的自我更新能力及很好的可塑性，可以向成骨細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、少突樹突細胞、肌細胞等細胞分化，但骨髓源性干細胞在人體的存在數(shù)量有限，取材時對患者造成的痛苦較大，成本也較高，一時間成為骨組織工程修復骨缺損及軟骨缺損發(fā)展的瓶頸。2001年Zuk等[1

2、]人在人體的脂肪懸液中分離出了干細胞，這些脂肪源性干細胞[2.3]和骨髓源性干細胞具有相似的生物學特性，同樣可以向成骨細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、少突樹突細胞、肌細胞等細胞分化，況且脂肪源性干細胞來源廣泛、取材較容易、對患者造成的痛苦也較小，可以作為修復骨缺損、軟骨缺損理想的種子細胞，成為近年來研究的熱點。
　　 目的:1.分離兔脂肪源性干細胞。2.研究脂肪源性干細胞最佳的生長條件及生物學特性。3.經(jīng)流式細胞儀檢測脂肪

3、源性干細胞CD29、CD34、CD44、CD45的陽性率。4.繪制脂肪源性干細胞的細胞生長曲線。5.研究兔脂肪源性干細胞在成骨誘導條件下的成骨誘導潛能，并用Gomori萘酚磷酸酯法染色及Von Kossa染色，檢驗成骨誘導結(jié)果。6.研究兔脂肪源性干細胞在成軟骨誘導條件下的成軟骨誘導潛能[4]，并用阿利新蘭染色及番紅花-亮綠染色，檢驗成軟骨誘導結(jié)果。7.篩選成軟骨分化相關(guān)的miRNA，分析成軟骨分化過程中相關(guān)的miRNA在脂肪源性干細胞成

4、軟骨分化過程中的表達模式。
　　 方法:1.脂肪源性干細胞的分離用水合氯醛對兔行腹腔注射麻醉，備皮、消毒、鋪巾，無菌操作下沿腹部中線旁2cm處剪開約5cm大小切口，暴露其皮下白色脂肪組織，剪去表層筋膜及小血管，用PBS緩沖液洗滌，移入安瓿瓶，在超凈工作臺中用眼科剪剪碎成糊狀，加入2倍體積0.1％(I)型膠原酶，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱消化60min，消化完成后加入等體積含10％胎牛血清的DMEM/F12終止消化，200目篩網(wǎng)過濾，1

5、000r/min離心10min，去上清，加入含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，輕柔吹打均勻，接種于25C m2的培養(yǎng)瓶中，置入37℃，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液1次，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長，待細胞融合約80％時去除培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。2.脂肪源性干細胞流式細胞儀檢測用胰酶消化法收集第5代脂肪間充質(zhì)干細胞，調(diào)整密度為109/L,取CD29-PE，CD34-PE，CD4

6、4-PE，CD45-PE單克隆抗體各5ul，細胞懸液100μl，混勻后避光孵育15min，加PBS500μl重懸，流式細胞儀檢測。3.繪制細胞生長曲線取第3、5、10、15代ADSCs，密度調(diào)整為1×107個/L，接種于96孔板，每孔200μl，各代4個復孔。每日取1板，每孔加入5g/L MTT20μl，37℃孵育5h，加DMSO150μl，輕輕震蕩10min，酶標儀490nm波長處測吸光度(A)值，連測9d，以細胞吸光度值(A)為縱坐

7、標，時間(d)為橫坐標，繪制生長曲線。4.脂肪源性干細胞成骨誘導分化當原代細胞傳代至第3代并覆蓋瓶底約80％時，消化瓶底細胞并收集，接種于6孔板中，3孔為實驗組，剩余3孔為對照組，24h后更換為含DMEM/F12，10％FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μg/ml抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導液，對照組加入普通培養(yǎng)液，誘導2周后取細胞爬片進行Gomori萘酚磷酸酯法與VonKossa染色，定期倒置顯微鏡下觀察細

8、胞形態(tài)變化并拍攝記錄。5.脂肪源性干細胞成軟骨誘導分化當脂肪源性干細胞的原代細胞傳至第3代并覆蓋瓶底約80％時，消化瓶底細胞并收集，接種于6孔板中，3孔為實驗組，剩余3孔為對照組，24h后更換為含DMEM/F12，0.1μmol/L地塞米松，50μg/ml維生素C，10 ng/mlTGF-β1，6.25μg/ml胰島素，6.25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白成軟骨誘導液，對照組加入普通培養(yǎng)液，誘導2周后取細胞爬片行阿利新蘭染色及番紅花-亮綠染色，定

9、期倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍攝記錄。6.基因芯片篩選成軟骨相關(guān)miRNA從兔腹部皮下脂肪組織中分離、培養(yǎng)脂肪源性干細胞。應用基因芯片技術(shù)篩選脂肪源性干細胞成軟骨誘導前后表達差異顯著的miRNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測差異顯著的miRNA，在成軟骨誘導第7天、第14天、第21天上調(diào)和下調(diào)相對表達強度，以ELISA試劑盒檢測相應時間點成軟骨相關(guān)蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果:1.脂肪源性干細胞形態(tài)學觀察6h后原代細胞大部分貼壁

10、，呈圓形、短梭形或多角形，分布均勻，至36h大部分細胞成長梭形，細胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)有明顯顆粒，72h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天達80％融合，用胰蛋白酶傳代培養(yǎng)，24h后呈纖維樣形態(tài)，漩渦狀、輻射狀或平行樣排列，分布均勻，3～4d達80％融合。隨傳代次數(shù)增加，細胞形態(tài)無明顯改變，傳代細胞較原代細胞明顯增大。2.脂肪源性干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果流式細胞儀檢測結(jié)果顯示不同代數(shù)細胞表型檢測結(jié)果CD29、CD44均高表達，陽性率均在95％以上

11、，且隨代數(shù)增加而無明顯下降趨勢，CD34、CD45呈低表達，陽性率均低于5％。3.脂肪源性干細胞生長曲線結(jié)果顯示第3、5、10、15代脂肪間充質(zhì)干細胞的生長曲線無明顯差異，均成“S”形，約4天進入對數(shù)生長期，約6天達峰值，隨代數(shù)增加生長曲線無明顯變化。4.脂肪源性干細胞成骨誘導分化鑒定取第2、4、6、8代細胞用成骨誘導液分化后分別用Gomori萘酚磷酸酯法染色(ALP染色)、VonKossa染色。隨誘導時間延長，ALP染色表現(xiàn)為堿性磷酸

12、酶陽性的細胞逐漸增多，多表現(xiàn)為棕褐色顆粒，Von Kossa法礦化結(jié)節(jié)染色見鈣結(jié)節(jié)呈黑色，表現(xiàn)為VonKossa陽性，而加入普通培養(yǎng)基的對照組均為陰性表現(xiàn)。5.脂肪源性干細胞成軟骨誘導分化鑒定取第2、4、6、8代細胞用成軟骨誘導液分化后分別用阿利新蘭染色及番紅花-亮綠染色，隨誘導時間延長，阿利新蘭染色后誘導細胞成藍色，呈阿利新蘭染色陽性;番紅花-亮綠染色后誘導細胞成紅色，無綠色，呈番紅花-亮綠染色陽性。6.成軟骨誘導前后miRNA基因芯

13、片篩選結(jié)果脂肪源性干細胞在傳至第4代后可獲得均一性較高的脂肪源性干細胞;基因芯片技術(shù)篩選出成軟骨分化前后表達差異明顯的10個miRNA，其中6個上調(diào)，4個下調(diào);成軟骨相關(guān)蛋白Ⅱ型膠原、X型膠原、Aggrecan的質(zhì)量濃度在成軟骨分化第7天明顯升高，第14天達峰值，第21天略有下降。
　　 結(jié)論:脂肪源性干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果顯示不同代數(shù)細胞表型檢測結(jié)果CD29、CD44均高表達，陽性率均在90％以上，且隨代數(shù)增加而無明顯下降趨

14、勢，CD34、CD45呈低表達，陽性率均低于10％，其中CD29在血管發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，CD44在新生細胞外基質(zhì)生成過程中起重要作用，這種檢測結(jié)果和骨髓源性干細胞的檢測結(jié)果一致，說明在細胞表面分子表達上脂肪源性干細胞和骨髓源性干細胞具有很相似的共性。繪制生長曲線，結(jié)果顯示第3、5、10、15代脂肪源性干細胞的生長曲線無明顯差異，均成“S”形，約4天進入對數(shù)生長期，約6天達峰值，隨代數(shù)增加生長曲線無明顯變化，說明脂肪源性干細胞的增值特

15、點較穩(wěn)定，可多次重復利用。6h后原代細胞大部分貼壁，呈圓形、短梭形或多角形，分布均勻，至36h大部分細胞成長梭形，細胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)有明顯顆粒，72h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天達80％融合，用胰蛋白酶傳代培養(yǎng)，24h后呈纖維樣形態(tài)，漩渦狀、輻射狀或平行樣排列，分布均勻，3～4d達80％融合。隨傳代次數(shù)增加，細胞形態(tài)無明顯改變，傳代細胞較原代細胞明顯增大，多次培養(yǎng)的脂肪源性干細胞生物學特性較穩(wěn)定，易于分離和培養(yǎng)，經(jīng)液氮冷凍保存及復蘇后

16、，生物學特性無明顯變化。本實驗證明了脂肪源性干細胞在誘導條件下具有向成骨分化的潛能，傳代后各項生物特性指標無明顯下降，生物性能穩(wěn)定，切取材方便、創(chuàng)傷小，可作為修復骨缺損的理想的種子細胞。脂肪源性干細胞在成軟骨誘導條件下，分別用阿利新蘭染色及番紅花-亮綠染色，均呈陽性表達，有酸性粘多糖的分泌，而軟骨細胞的主要功能就是分泌酸性粘多糖和膠原蛋白，本實驗隨時間的延長，染色結(jié)果有加重的趨勢，分泌酸性粘多糖和膠原蛋白的含量有增加的趨勢，證明了脂肪源