OsVHA-A基因生化及生物學(xué)功能研究與分析.pdf

1、植物細(xì)胞中主要存在三種類型的質(zhì)子泵，即質(zhì)膜質(zhì)子泵(P型H+-ATP酶)、液泡膜質(zhì)子泵(V型H+-ATP酶)以及定位于液泡膜上的V-PPase。這三大質(zhì)子泵除完成主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的功能外，還伴隨著對(duì)其他溶質(zhì)（離子）的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。位于質(zhì)膜上以單鏈多肽形式存在的H+-ATP酶（PM H+-ATPase），此質(zhì)子泵，在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中需要ATP供能，并且其活化依賴于磷酸化，在植物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、氣孔運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和胞內(nèi)氫離子的穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程中發(fā)揮著非常

2、重要的功能；位于液泡膜上以多亞基復(fù)合體形式存在的H+-ATP酶（V-ATPase），運(yùn)輸時(shí)也需要ATP供能,但其活化不依賴于磷酸化，V-型ATPase在植物的胚性發(fā)育，細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其是液泡和其他囊泡內(nèi)腔的酸化上發(fā)揮著重要的功能；而位于液泡膜上以同源二聚體形式存在的H+-無(wú)機(jī)焦磷酸酶(H+-pyrophosphatase, V-PPase)，它能夠?qū)o(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)水解為2個(gè)Pi，和H+-ATPase一起將細(xì)胞質(zhì)中的H+泵入液泡中，一

3、方面建立跨液泡膜電化學(xué)梯度，為無(wú)機(jī)離子及其他溶質(zhì)進(jìn)出液泡提供驅(qū)動(dòng)力；另一方面，可以使液泡酸化，有利于細(xì)胞質(zhì)中生理生化反應(yīng)的順利進(jìn)行。
　　氣孔是植物在生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫條件下與外界進(jìn)行氣體和水分交換的重要門戶，有大量的基因已經(jīng)被證明參與氣孔開度和密度的調(diào)節(jié)，其中包括編碼V-ATPase復(fù)合體的亞基的某些基因，如V-ATPase復(fù)合體中的C亞基。擬南芥突變體det3（缺失V-ATPase復(fù)合體C亞基）由于終止了Ca2+流的震

4、蕩，從而使植株喪失了調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉的功能。V-ATPase A亞基作為V-ATPase的催化中心，同時(shí)也具有 ATP綁定的能力。在鹽脅迫和滲透脅迫的研究中，眾多的報(bào)道發(fā)現(xiàn)V-ATPase A亞基的轉(zhuǎn)錄水平都有明顯的上升。雖然如此，但是對(duì)于V-ATPase A亞基在逆境脅迫中的主要功能和機(jī)制還不清楚，尤其是水稻OsVHA-A基因在植株生長(zhǎng)發(fā)育和非生物協(xié)調(diào)下的作用機(jī)制還沒有研究報(bào)道。
　　運(yùn)用反向遺傳學(xué)的手段，我們首先克隆得到水稻OsV

5、HA-A基因，利用RNAi技術(shù)構(gòu)建了pHB-OsVHA-A RNAi載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染，我們成功的將該載體轉(zhuǎn)化到野生型水稻日本晴，并獲得了轉(zhuǎn)基因水稻。此外，我們也構(gòu)建了OsVHA-A過(guò)表達(dá)的載體。我們?cè)谘芯吭摶蚬δ艿臅r(shí)候首先發(fā)現(xiàn)該基因參與了對(duì)氣孔的調(diào)控，并且pHB-OsVHA-A RNAi轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽和滲透脅迫的敏感性可能是通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔的發(fā)育和開度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)，OsVHA-A基因在

6、水稻的各個(gè)組織均有表達(dá)，但在葉和花中的表達(dá)量較多。并且將構(gòu)建好的GFP-OsVHA-A融合蛋白載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白只定位于液泡膜上。同時(shí)，將 pEYS2-OsVHA-A載體轉(zhuǎn)化到酵母突變體 vma1Δ（缺失V-ATPase A亞基）中發(fā)現(xiàn)，異源的表達(dá)OsVHA-A能夠在很大程度上彌補(bǔ)突變體在高pH值和高pH值加CaCl2的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的表型，這可能也預(yù)示了定位于液泡膜上的

7、OsVHA-A基因編碼的蛋白可能具有 V-ATPase活性。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在OsVHA-A RNAi轉(zhuǎn)基因植株中，沉默OsVHA-A基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致位于液泡膜上的V-ATPase活性顯著性下降以及液泡內(nèi)pH值的上升，這更加佐證了OsVHA編碼的蛋白在調(diào)控V-ATPase活性以及液泡內(nèi)酸化上的重要功能。此外，在對(duì)表型的分析中，我們發(fā)現(xiàn)在正常生理?xiàng)l件下，pHB-OsVHA-A RNAi轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)均比野生型水稻日本晴顯著性增長(zhǎng)。而

8、對(duì)成熟植株的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中葉綠素的含量較之于野生型而言，有著明顯的上升，并且植株表現(xiàn)為株高矮小，分蘗數(shù)增多的性狀。對(duì)T2成熟種子的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻的種子粒寬和千粒重較之于野生型而言都有所增加。然而對(duì)過(guò)表達(dá)植株的分析發(fā)現(xiàn)，這些農(nóng)藝學(xué)性狀較之于WT而言，并沒有明顯的變化。進(jìn)一步電子掃描電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)，在RNAi轉(zhuǎn)基因植株中，較之于野生型而言，氣孔的開度和密度都有所增加，此外轉(zhuǎn)基因植株離體葉片的失水率的統(tǒng)計(jì)也證實(shí)了這一結(jié)論

9、。這可能說(shuō)明了 OsVHA-A RNAi通過(guò)誘導(dǎo)氣孔的發(fā)育和開放，促進(jìn)了植株的生長(zhǎng)。而在逆境條件下的觀察發(fā)現(xiàn)，RNAi轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽和干旱均比較敏感，原子吸收光譜測(cè)定的離子含量分析發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株中K+, Na+離子的含量較之于野生型而言都有明顯增加。此外，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在RNAi轉(zhuǎn)基因植株中，正常生理?xiàng)l件下用非損傷離子檢測(cè)技術(shù)測(cè)定的質(zhì)子外排流速要顯著性的大于野生型植株。20％PEG處理?xiàng)l件下，促使了H+離子的外排轉(zhuǎn)化為H+離

10、子的內(nèi)流，然而RNAi轉(zhuǎn)基因植株對(duì)H+離子的吸收能力似乎明顯低于野生型水稻。在MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并添加20%PEG模擬干旱處理?xiàng)l件下，RNAi轉(zhuǎn)基因植株的滲透壓也明顯低于對(duì)照組，而電導(dǎo)率則顯著性高于野生型水稻，氣孔的開度也明顯高于對(duì)照組。與此同時(shí)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，我們檢測(cè)了影響氣孔開度的關(guān)鍵基因如：鈣調(diào)蛋白（CAM1和CAM3）、氣孔密度的負(fù)調(diào)節(jié)基因YDA和質(zhì)膜上的質(zhì)子泵PMA3基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)水稻OsVHA-A

11、基因的表達(dá)導(dǎo)致了YDA、CAM1和CAM3基因的顯著性下調(diào)；以及質(zhì)膜上的質(zhì)子泵PMA3基因的顯著性上升。
　　通過(guò)對(duì)上述結(jié)果的分析，我們進(jìn)一步總結(jié)了水稻OsVHA-A基因的功能機(jī)制：OsVHA-A基因表達(dá)量的下調(diào)，導(dǎo)致液泡V-ATPase活性的下降和液泡pH值的上升，這個(gè)過(guò)程誘使了胞質(zhì)中H+離子含量的上升，并造成質(zhì)膜上的質(zhì)子泵PMA3基因表達(dá)的上升，最終加速了H+離子的外排，與此同時(shí)，質(zhì)子外排引發(fā)的質(zhì)膜的超極化又促使了Ca2+和K

12、+離子的內(nèi)流，最終表現(xiàn)為氣孔的關(guān)閉失控，即開度增加；同時(shí)OsVHA-A基因表達(dá)的沉默又促使了和Ca2+聯(lián)系緊密的氣孔密度負(fù)調(diào)控因子YDA基因的表達(dá)顯著性下降，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株氣孔密度的增加。pHB-OsVHA-A RNAi轉(zhuǎn)基因植株氣孔開度和密度的增加一方面導(dǎo)致RNAi轉(zhuǎn)基因植物在非生物脅迫時(shí)蒸騰作用增大，失水率增加，從而表現(xiàn)為敏感癥狀；另一方面，氣孔開度和密度的增加又有利于RNAi轉(zhuǎn)基因植物吸收光合作用的原料-CO2，促使光合效率增加