NDRG2在結(jié)腸癌演變中對(duì)TGF-β通路功能的影響及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一,在全球范圍內(nèi),結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在男性和女性患者中均位列第三位。目前研究認(rèn)為,結(jié)腸上皮細(xì)胞遺傳學(xué)的改變是導(dǎo)致結(jié)腸癌易感性的主要原因,如Ras/Raf, transforming growth factor(TGF)-β,β-catenin/T-cell factor(TCF)和p53通路等。在結(jié)腸癌演變過(guò)程中,基因的突變和微環(huán)境的改變進(jìn)一步增加了結(jié)腸癌惡性表型的發(fā)生。因此,結(jié)腸癌的發(fā)生是一個(gè)多因

2、素、多階段、各種分子事件漸進(jìn)性累積的復(fù)雜過(guò)程。盡管關(guān)于上述機(jī)制的研究已經(jīng)逐漸明確,但導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素仍然有待進(jìn)一步的研究。
　　TGF-β屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族的成員,其通過(guò)自分泌或旁分泌的方式參與細(xì)胞內(nèi)許多生物學(xué)行為的調(diào)控。經(jīng)典的TGF-β信號(hào)通路是通過(guò)Smad蛋白家族來(lái)介導(dǎo),主要參與成員是Smad2/3/4;另外,TGF-β還可以激活細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為,如:Ras/MAPK/ERK通路,

3、JNK/P38通路,PI3K/AKT通路, RohA通路,PP2A/p70s6K通路等。TGF-β信號(hào)通路的活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并在不同環(huán)境下表現(xiàn)出促癌或抑癌的雙向功能。目前的研究認(rèn)為,TGF-β/Smad信號(hào)通路在正常的上皮細(xì)胞中主要發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的功能,這主要是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子p15和p21的誘導(dǎo),以及對(duì)癌基因c-Myc的抑制效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的;但在晚期的結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi),TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞EMT及侵襲和轉(zhuǎn)

4、移的發(fā)生導(dǎo)致其功能從抑癌向促癌轉(zhuǎn)變。誘導(dǎo)TGF-β功能發(fā)生改變的原因很多,其中遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致 TGF-β增殖抑制通路的突變失活被認(rèn)為是最為重要的因素,例如:SMAD4, SMAD2和 TGFBR2等。但同時(shí)有許多的研究顯示,在結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)修復(fù)TGF-β缺陷的通路仍然不能有效激活TGF-β增殖抑制信號(hào)通路,這提示除了遺傳學(xué)改變外的其他因素,可能也參與到了對(duì)TGF-β雙向功能的調(diào)節(jié)。
　　NDRG2(N-Myc Downstream

5、 Regulated Gene2)是我們課題組首次報(bào)道的新抑癌基因。它屬于NDRG家族成員,該家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四個(gè)成員組成。課題組的前期研究結(jié)果顯示NDRG2可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,并可以誘導(dǎo)多種類(lèi)型細(xì)胞的分化,如樹(shù)突狀細(xì)胞,PC12細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞等。另外, NDRG2在結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中呈低表達(dá)狀態(tài),這與它作為腫瘤抑制基因所具有的潛在抑癌能力相一致。更重要的是,我們最近發(fā)現(xiàn)NDRG2的表達(dá)與

6、結(jié)腸癌的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有顯著的負(fù)相關(guān)性,其低表達(dá)狀態(tài)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān),顯示NDRG2是一新的結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物,為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制、臨床病理聯(lián)系及預(yù)后判斷提供新的思路。
　　目的：
　　1.揭示TGF-β在結(jié)腸癌演變過(guò)程中功能由抑癌向促癌轉(zhuǎn)變的原因及影響因素;
　　2.明確TGF-β對(duì)NDRG2調(diào)控的分子機(jī)制;
　　3.分析NDRG2在結(jié)腸癌演變過(guò)程中表觀遺傳學(xué)的改變對(duì)TGF-β功能的調(diào)節(jié);

7、　　4.闡明NDRG2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT及細(xì)胞增殖過(guò)程的影響。
　　方法和結(jié)果：
　　1. NDRG2與TGF-β通路在結(jié)腸癌演變過(guò)程中的相關(guān)性分析
　　我們首先分別在50例結(jié)腸癌和癌旁的病理組織中通過(guò)免疫組織化學(xué)方法分析了p-Smad2/3C和腫瘤抑制基因NDRG2的表達(dá)狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,p-Smad2/3C和NDRG2在低分化的惡性結(jié)腸癌中呈低表達(dá),兩者的表達(dá)也具有顯著的相關(guān)性。這提示NDRG2可能參與了TGF

8、-β/Smad通路對(duì)細(xì)胞的周期調(diào)控及增殖抑制效應(yīng)的過(guò)程。
　　2. TGF-β通過(guò)Sp1、c-Myc、Miz-1和Smad復(fù)合體調(diào)控NDRG2的轉(zhuǎn)錄
　　我們通過(guò)Western blot和Real-time PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β在HaCaT細(xì)胞中可以從轉(zhuǎn)錄水平直接激活 NDRG2的表達(dá)。并進(jìn)一步通過(guò)報(bào)告基因分析和 ChIP實(shí)驗(yàn)證明TGF-β通過(guò)調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞內(nèi)Smad2/3和Smad4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性,激活NDRG2的

9、轉(zhuǎn)錄;并且Sp1的過(guò)表達(dá)進(jìn)一步提高了TGF-β誘導(dǎo)NDRG2的啟動(dòng)子活性;而干涉Sp1或NDRG2啟動(dòng)子的Sp1結(jié)合位點(diǎn)突變可顯著抑制NDRG2的啟動(dòng)子活性;Sp1的抑制劑Mithramycin A作用細(xì)胞能夠抑制TGF-β對(duì)NDRG2的轉(zhuǎn)錄激活活性,進(jìn)一步說(shuō)明TGF-β調(diào)控NDRG2依賴(lài)Sp1的參與;除此之外,報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示, c-Myc通過(guò)對(duì)Miz-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用抑制 TGF-β對(duì)NDRG2的誘導(dǎo)表達(dá),而 Miz-1的過(guò)表

10、達(dá)則可上調(diào)NDRG2啟動(dòng)子活性。由此可見(jiàn),TGF-β可以通過(guò)Sp1、c-Myc、Miz-1和Smad復(fù)合體的介導(dǎo),參與對(duì)NDRG2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　3. NDRG2在結(jié)腸癌細(xì)胞中對(duì)TGF-β功能的影響
　　在晚期結(jié)腸癌細(xì)胞中,TGF-β/Samd通路通常發(fā)生突變失活,而TGF-β誘導(dǎo)的癌基因信號(hào)通路則被激活,TGF-β在這一階段可通過(guò)誘導(dǎo)EMT(上皮-間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變)的方式促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。我們通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、West

11、ern blot和Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn),NDRG2的過(guò)表達(dá)可顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生EMT,并從mRNA水平抑制TGF-β誘導(dǎo)的E-Cadherin和Vimentin表達(dá)的改變,提示NDRG2可能從轉(zhuǎn)錄水平影響著TGF-β對(duì)EMT的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步分析NDRG2對(duì)EMT導(dǎo)致的細(xì)胞惡性侵襲和轉(zhuǎn)移等功能上的改變,我們利用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察了細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。結(jié)果表明,TGF-β的刺激提高了 HT

12、-29細(xì)胞侵襲和遷移能力,而NDRG2的過(guò)表達(dá)則顯著抑制了TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變。因此,NDRG2作為T(mén)GF-β/Smad抗增殖通路的應(yīng)答基因,在晚期結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮對(duì) TGF-β誘導(dǎo)的EMT發(fā)生的抑制效應(yīng)。
　　4. NDRG2表觀遺傳學(xué)的改變?cè)诮Y(jié)腸癌演變中的重要意義
　　我們首先在多個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞株及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中比較了 NDRG2表達(dá)的差異,并觀察到NDRG2在大部分的結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)呈低表達(dá);而NDRG2在結(jié)腸

13、癌細(xì)胞的甲基化水平明顯高于正常細(xì)胞,并與NDRG2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);這一結(jié)果在結(jié)腸癌臨床標(biāo)本中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。另外,在NDRG2啟動(dòng)子高甲基化的細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Sp1不能誘導(dǎo)內(nèi)源性NDRG2的表達(dá)上調(diào),但卻保留了對(duì)外源轉(zhuǎn)染的NDRG2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活能力。通過(guò) EMSA實(shí)驗(yàn)證明,Sp1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的高基化狀態(tài)顯著抑制了Sp1與NDRG2啟動(dòng)子區(qū)靶位點(diǎn)的結(jié)合。而DNA甲基化酶抑制劑5-aza-dC的作用可以上調(diào) NDRG2的表達(dá)水平,并恢復(fù)

14、 Sp1對(duì) NDRG2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。為了探討NDRG2對(duì)EMT的抑制效應(yīng)在臨床上的表現(xiàn),我們?cè)?60例結(jié)腸病人標(biāo)本中分析了NDRG2的表達(dá)與結(jié)腸癌侵襲能力、淋巴轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,顯示 NDRG2的表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈顯著的負(fù)相關(guān),提示NDRG2作為腫瘤抑制基因,在發(fā)揮抗增殖效應(yīng)的同時(shí)還可以通過(guò)對(duì)EMT的調(diào)控抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　5. NDRG2參與結(jié)腸癌生物學(xué)行為改變的分子機(jī)制
　　結(jié)腸癌細(xì)胞在高生

15、長(zhǎng)密度時(shí)可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化,基于這一細(xì)胞特性,我們利用Caco-2和HT-29細(xì)胞建立了結(jié)腸癌分化的模型,并發(fā)現(xiàn)在分化后的結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)NDRG2的表達(dá)上調(diào)及癌基因Skp2的表達(dá)下調(diào)。另外,在丁酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞分化模型中,我們也證實(shí)了二者之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)NDRG2的過(guò)表達(dá)可從轉(zhuǎn)錄水平抑制Skp2的表達(dá),并同時(shí)上調(diào)Skp2的泛素化底物p27和p21的表達(dá)水平和蛋白穩(wěn)定性。除此,NDRG2還可以從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)p21的

16、表達(dá),但不改變p27的mRNA水平。因此,NDRG2一方面通過(guò)抑制Skp2的表達(dá)增強(qiáng)了p27和p21在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性,另一方面從轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)了 p21的表達(dá)。由此我們推測(cè)NDRG2對(duì)Skp2,p27和p21的調(diào)控可能是其參與抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化的主要方式。最后,我們通過(guò)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NDRG2的過(guò)表達(dá)顯著抑制了HT-29細(xì)胞的成瘤能力及細(xì)胞的增殖能力,p21或p27的干涉均不同程度地促進(jìn)了瘤體的增殖,并可部分的解除NDRG

17、2對(duì)腫瘤的增殖抑制效應(yīng)。因此,NDRG2通過(guò)調(diào)節(jié)p21和p27的表達(dá)參與對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖分化過(guò)程的調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)對(duì)本課題的研究,我們發(fā)現(xiàn) TGF-β可以通過(guò) Sp1、c-Myc、Miz-1和Smad復(fù)合體的介導(dǎo),參與對(duì)抑癌基因NDRG2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由于在晚期結(jié)腸癌中NDRG2啟動(dòng)子的高甲基化導(dǎo)致NDRG2對(duì)TGF-β的應(yīng)答缺陷,從而導(dǎo)致TGF-β增殖抑制效應(yīng)的缺失,而TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程不能被有效地抑制,