應用基因芯片技術探索Nrf2介導的乳腺癌阿霉素耐藥機制初步研究.pdf

1、背景：
　　化療是乳腺癌治療方案的重要組成部分，能夠殺傷或控制體內微小腫瘤病灶。乳腺癌對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是患者腫瘤復發(fā)或遠處轉移，導致治療失敗的主要原因。目前含阿霉素類的化療方案使用廣泛，成為乳腺癌患者術后輔助化療一線藥物。但臨床上阿霉素類的耐藥現(xiàn)象發(fā)生率相當高。據(jù)研究報道，Nrf2信號通路與腫瘤耐藥相關，而Nrf2與乳腺癌阿霉素耐藥的相關研究較少。因此對Nrf2與乳腺癌阿霉素耐藥的相關性進行深入研究非常必要。
　　目的：

2、
　　通過Nrf2-siRNA穩(wěn)定轉染人乳腺癌阿霉素耐藥細胞株MCF7/ADR，初步研究Nrf2對乳腺癌細胞生物學特性（增殖、凋亡）的影響，并探索Nrf2的表達水平與乳腺癌阿霉素耐藥相關性;應用基因芯片技術檢測經(jīng)Nrf2-siRNA穩(wěn)定轉染的MCF-7/ADR細胞株與對照組MCF-7/ADR細胞株之間的基因表達譜差異，篩選耐藥相關基因，探討與乳腺癌耐藥相關的Nrf2潛在下游基因。本研究促進對乳腺癌耐藥機制的了解，在增加乳腺癌化療敏

3、感性及提高乳腺癌化療療效方面，有較大意義。
　　方法：
　　本研究選擇MCF-7/ADR細胞株作為研究對象，經(jīng)Nrf2-RNAi成功穩(wěn)定轉染MCF7/ADR細胞株，沉默Nrf2目的基因表達。通過熒光顯微鏡下觀察計算轉染效率并應用Real timePCR檢測siRNA對Nrf2 mRNA的干擾效率。成功轉染后通過表柔比星（表阿霉素）藥物實驗、MTT法檢測細胞增殖、流式細胞儀檢測細胞凋亡;基因芯片檢測經(jīng)Nrf2-siRNA成功轉

4、染后的MCF-7/ADR細胞株與對照組細胞株基因表達譜的差異，篩選出基因差異倍數(shù)(|FC|)＞1.5倍的差異基因，結合生物信息學及基因差異的顯著性，篩選出與乳腺癌細胞耐藥相關的基因。并初步探討差異基因在pathway信號通路的富集及GO分析(Gene Ontology Analysis)。
　　結果：
　　1、慢病毒成功轉染目的細胞MCF-7/ ADR細胞，經(jīng)過穩(wěn)定傳代后，以RT-PCR檢測干擾組與對照組Nrf2 mRNA相

5、對表達量，結果發(fā)現(xiàn)，相對于陰性對照組，干擾組中Nrf2基因敲減效率達到54.3％，符合表達譜芯片實驗的要求(p＜0.05);
　　2、表柔比星作用穩(wěn)定轉染Nrf2-shRNA的MCF-7/ADR細胞(KD)及對照組細胞株(NC)后，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)Nrf2-shRNA轉染的MCF-7/ADR細胞較對比組細胞在多個表柔比星藥物濃度中增殖較為緩慢，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3、接著以流式細胞儀檢測兩株細胞的凋亡率，結果發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐

6、藥細胞株轉染Nrf2-siRNA后，對表柔比星的耐藥性發(fā)生逆轉，對表柔比星更敏感，轉染Nrf2-siRNA后的細胞株凋亡率更高(P＜0.05)
　　4、通過基因芯片檢測成功敲除目的基因（穩(wěn)定轉染Nrf2-shRNA）前后MCF-7/ADR細胞株差異表達基因，共篩選出具有差異倍數(shù)(| FC|)＞1.5的基因878個，涉及多種分子功能，參與多個生物學過程。其中表達上調的基因341個，表達下調的基因537個。結合生物信息學及基因差異顯著

7、性，篩選出與乳腺癌細胞耐藥相關的關鍵基因，下調的基因主要包括RAC1、ASNS、NRP1以及SNAI2等，上調的基因主要為PHLPP2等。
　　結論：
　　1.本研究結果表明，通過沉默Nrf2基因表達，可提高乳腺癌阿霉素耐藥細胞株對阿霉素的敏感性(P＜0.05)，證實了Nrf2與乳腺癌阿霉素耐藥性相關。
　　2.乳腺癌耐藥是一個及其復雜的過程，通過基因芯片技術并結合生物信息學方法篩選出具有顯著差異性的基因，其中差異較顯