RBM8A與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性及對肝細(xì)胞癌增殖及凋亡生物學(xué)特性的影響.pdf

1、一、RBM8A與人肝細(xì)胞癌相關(guān)性的臨床初步研究
　　目的：有研究顯示RBM8A與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有密切相關(guān)性。然而，RBM8A與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性尚未有明確報道。本研究旨在首先通過檢測RBM8A在肝細(xì)胞癌組織、相關(guān)癌旁組織、肝血管瘤組織中的表達(dá)水平的差異，以及檢測肝細(xì)胞癌患者與肝硬化患者、正常體檢人群血清樣本中RBM8A的表達(dá)差異，初步探討RBM8A與肝細(xì)胞癌發(fā)生相關(guān)性、以及RBM8A的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者腫瘤學(xué)特征及者預(yù)后

2、的相關(guān)性。分析將RBM8A作為肝細(xì)胞癌輔助診斷指標(biāo)及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)的潛在可能性。
　　方法：收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2012年3月至2014年12月間經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實為肝細(xì)胞癌的組織105例，并收集相應(yīng)距離腫瘤邊緣2cm處的癌旁組織。另收集經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實為肝血管瘤的組織67例。運用qRT-PCR法、Western Blot法、免疫組織化學(xué)法檢測并分析RBM8A的 mRNA及蛋白在肝細(xì)胞癌組織、相應(yīng)癌旁組織、

3、及肝血管瘤組織中的表達(dá)差異；根據(jù)RBM8A在肝細(xì)胞癌組織中的mRNA含量及蛋白表達(dá)狀況，將肝細(xì)胞癌患者分成高表達(dá)組與低表達(dá)組，初步分析RBM8A的表達(dá)量和肝細(xì)胞癌患者腫瘤學(xué)及臨床特征的相關(guān)性；并根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果，運用Kaplan-Meier生存曲線法分析計算RBM8A低表達(dá)組與高表達(dá)組肝癌患者的無進(jìn)展生存（Progression-free Survival，PFS）和總生存（Overall Survival，OS）時間，并用Lo

4、g-rank檢驗兩組間是否存在統(tǒng)計學(xué)差異，初步分析RBM8A的表達(dá)量和肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系。另收集肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者及正常體檢人群的血清標(biāo)本各110例，運用ELISA法聯(lián)合檢測上述人群血清中RBM8A、AFP的表達(dá)差異，繪制ROC曲線，根據(jù)cut off值指示RBM8A+ AFP診斷HCC敏感度及特異性匹配最佳時的濃度值，分析聯(lián)合檢測RBM8A+ AFP對于提高診斷HCC敏感性及特異性的價值并將RBM8A作為肝癌輔助診斷指標(biāo)的可

5、行性。
　　結(jié)果：（1）qRT-PCR顯示： RBM8A mRNA在肝細(xì)胞癌組織中的平均表達(dá)量為△△CT=7.99595±5.49764,在癌旁組織中的平均表達(dá)量為△△CT=4.6667±3.78338，在肝血管瘤組織中的平均表達(dá)量為△△CT=1.6460±1.53852，結(jié)果顯示RBM8A mRNA的表達(dá)情況為肝細(xì)胞癌組織>癌旁組織>肝血管瘤組織（P<0.05）。（2）免疫組化結(jié)果顯示：RBM8A蛋白在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織、肝

6、血管瘤組織中陽性率分別85％、61.67%、5.71%，結(jié)果顯示RBM8A蛋白的表達(dá)情況為肝細(xì)胞癌組織>癌旁組織>肝血管瘤組織（P<0.0001）；（3）western blot結(jié)果顯示：RBM8A在肝細(xì)胞癌組織中平均灰度值為IA(RBM8A)/IA(β-actin)=1.86±0.36；癌旁組織中平均灰度值為IA(RBM8A)/IA(β-actin)=1.35±0.32；肝血管瘤組織中平均灰度值為IA(RBM8A)/IA(β-acti

7、n)=0.95±0.35（P<0.05）。結(jié)果顯示RBM8A蛋白的表達(dá)情況為肝細(xì)胞癌組織>癌旁組織>肝血管瘤組織（P<0.0001）。（4）將qRT-PCR與免疫組化檢測結(jié)果與肝癌患者臨床病特征進(jìn)行分析：①RBM8A的蛋白表達(dá)水平與腫瘤直徑、HBsAg、TNM分期、Edmondson病理分級呈正相關(guān)（P＜0.05）。②RBM8A低表達(dá)組患者的總體OS和DFS均較高表達(dá)組延長（P<0.05)。（4）qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，以RBM8A

8、mRNA在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)量為7.99595為界，105例肝細(xì)胞癌患者中85例為高表達(dá)（80.95%）。RBM8A mRNA含量高表達(dá)與HbsAg（P<0.001）、Edmondson病理分級(P=0.004)之間具有顯著相關(guān)性；免疫組化檢測結(jié)果顯示，105例肝細(xì)胞癌組織中RBM8A表達(dá)為陽性的有92例（陽性率87.62%）。RBM8A蛋白表達(dá)的陽性率與HBsAg（P<0.001）、腫瘤直徑(P=0.013)、TNM分期（P<0.00

9、1）、Edmondson病理分級(P=0.003)之間具有顯著相關(guān)性。（5）免疫組化的結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌患者中為RBM8A高表達(dá)組（強陽性及陽性）的有64例（60.95%），低表達(dá)組（弱陽性及陰性）的有41例（39.05%），低表達(dá)組患者和高表達(dá)組患者的RBM8A總體生存期（OS）分別為229天和160天(P<0.001)，兩組患者的無進(jìn)展生存期（PFS）分別為114天和90天(P<0.001)。結(jié)果表明RBM8A低表達(dá)組患者的總體生存

10、期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）均長于表達(dá)組患者。（6）ELISA檢測結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌患者血清中RBM8A的蛋白表達(dá)水平明顯高于肝硬化組和正常肝組織患者血清中RBM8A的蛋白表達(dá)水平；并且，單純檢測血清AFP時，診斷肝癌的敏感性為70.0%，聯(lián)合檢測血清中RBM8A、AFP時，診斷肝癌的明顯提升為86.3%。提示聯(lián)合檢測血清中RBM8A及AFP水平有助于提高診斷肝癌的敏感性，而對于提高診斷肝癌的特異性性則不明顯促進(jìn)作用。
　　

11、結(jié)論：RRBM8A的異常高表達(dá)可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且RRBM8A具有作為診斷、篩查肝細(xì)胞癌輔助指標(biāo)、預(yù)測肝細(xì)胞惡性程度及患者預(yù)后指標(biāo)的潛在可能性。
　　二、RBM8A與肝癌細(xì)胞增殖及凋亡特性的基礎(chǔ)實驗研究
　　目的：在初步探討RBM8A的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌腫瘤學(xué)特征及肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建RBM8A低表達(dá)及過表達(dá)的細(xì)胞株，檢測RBM8A低表達(dá)或過表達(dá)后肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力、凋亡

12、能力及細(xì)胞周期的的變化，進(jìn)一步探討RBM8A基因?qū)τ诟渭?xì)胞癌形成的有關(guān)生物學(xué)活動的影響。
　　方法：（1）采用western blot對一系列體外肝癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測，選取RBM8A表達(dá)水平最高的細(xì)胞株，設(shè)計并篩選RBM8A干擾序列，構(gòu)建敲低慢病毒和對照病毒，感染靶細(xì)胞；經(jīng)qRT-PCR驗證RBM8A敲低效率(敲低效率70%以上)，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染RBM8A-KD細(xì)胞株，并建立空載RBM8A-NC細(xì)胞株作為對照；（2）采用wester

13、n blot對一系列體外肝癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測，選取RBM8A表達(dá)水平最低的細(xì)胞株，調(diào)取RBM8A基因的編碼序列（Coding Sequence，CDS）序列，構(gòu)建到慢病毒過表達(dá)載體上；采用包裝過表達(dá)慢病毒及對照慢病毒，感染靶細(xì)胞；經(jīng)western blot驗證RBM8A過表達(dá)效率；獲得穩(wěn)定RBM8A高表達(dá)的RBM8A-OE細(xì)胞株，并建立空載RBM8A-NC細(xì)胞株作為對照；（3）在以上構(gòu)建的細(xì)胞系）中采用CCK-8檢測細(xì)胞的增殖能力變化；（

14、4）FACS(AnnexinⅤ-PE/7AAD)檢測上述四株細(xì)胞凋亡能力變化；（5）FACS檢測上述四株細(xì)胞周期變化；（6）劃痕實驗檢測敲低及回補后RBM8A后細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的變化；（7）Transwell實驗檢測敲低及回補后RBM8A后細(xì)胞侵襲能力的變化；（8）細(xì)胞骨架染色檢測檢測敲低及回補后RBM8A后細(xì)胞骨架形態(tài)學(xué)的變化。
　　結(jié)果：（1）Western blot篩選結(jié)果表明，Bel-7404細(xì)胞株的RBM8A表達(dá)水平最高，用

15、于后續(xù)構(gòu)建Bel7404-RBM8A-KD細(xì)胞株；而HL-7702細(xì)胞株RBM8A表達(dá)水平最低，用于后續(xù)構(gòu)建HL7702-RBM8A-OE細(xì)胞株；（2）CCK8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明：Bel-7404細(xì)胞株在RBM8A被敲低后，細(xì)胞增值能力下降（P=0.00325）；HL-7702細(xì)胞株在RBM8A過表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力上升（P=0.00159）；（3）流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明：Bel-7404細(xì)胞株中RBM8A被敲低后，細(xì)胞凋亡明顯增加（

16、P=0.0004）；HL-7702細(xì)胞株中RBM8A過表達(dá)后，細(xì)胞凋亡明顯下降（P=0.000358）；（4）流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明：Bel-7404細(xì)胞株中RBM8A被敲低后，S期細(xì)胞量較NC組有所上升，G1期有所下降；（5）劃痕實驗、transwell侵襲實驗結(jié)果顯示：Bel-7404細(xì)胞株中RBM8A被敲低后，肝癌細(xì)胞遷移降低（P=0.04383）、侵襲能力下降（P=0.0089），而RBM8A回補后肝癌細(xì)胞侵襲再次明顯增強(P=

17、0.020727)、轉(zhuǎn)移能力再次亦明顯增強（P=0.0016）；（6）細(xì)胞骨架染色觀測結(jié)果顯示Bel-7404細(xì)胞株中RBM8A被敲低后，肝癌細(xì)胞形態(tài)變化明顯，呈現(xiàn)偏圓、少偽足形態(tài)；而RBM8A回補后肝癌細(xì)胞形態(tài)再次變?yōu)榕c空載組細(xì)胞形態(tài)相似。
　　結(jié)論：下調(diào)RBM8A基因后肝細(xì)胞癌細(xì)胞的分化增殖能力、轉(zhuǎn)移侵襲能力明顯下降，而凋亡能力明顯增強，并且細(xì)胞周期有停滯在S期的趨勢。此研究表明RBM8A基因?qū)τ谡T導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期