X-射線照射后4T1腫瘤細胞釋放的外泌體對體內(nèi)外腫瘤增殖、遷移的影響及其作用機制研究.pdf

1、目的：放療是腫瘤治療的有效方法之一，目前約有一半的腫瘤患者依賴放療。但放療也存在一些問題，如單獨放療很難根除腫瘤，甚至在一些情況下還會造成腫瘤的播散或轉(zhuǎn)移。某些實體腫瘤經(jīng)一定劑量的射線照射后，容易發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），形成循環(huán)腫瘤細胞（CTCs），使腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加。CTCs相當(dāng)于腫瘤的“種子”，合適的微環(huán)境對CTCs的募集及定植至關(guān)重要，而免疫失衡狀態(tài)的微環(huán)境顯然有利于CTCs的定植與生長。腫瘤來源的外泌體（tumor deri

2、ved exosomes，TD-exosomes）是由腫瘤細胞釋放的直徑為30-150nm的內(nèi)吞囊泡，通過攜帶蛋白質(zhì)、DNA、RNAs及miRNAs等信息分子參與細胞間的聯(lián)系。本實驗以小鼠乳腺癌細胞系（4T1）及其荷瘤小鼠為模型，觀察4T1細胞經(jīng)X-射線照射后分泌的外泌體對4T1生長和遷移的影響及其對小鼠巨噬細胞的作用，并探討4T1經(jīng)X-射線照射后分泌的外泌體對腫瘤遷移的可能機制。
　　方法：
　　1.X-射線照射誘導(dǎo)小鼠乳

3、腺癌4T1細胞凋亡和EMT轉(zhuǎn)化
　　1.1.體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細胞，采用不同劑量的X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射，24h后收集細胞，PE-AnnexinV和7-AAD標記細胞，流式細胞術(shù)觀察4T1細胞的凋亡情況。
　　1.2.4T1細胞經(jīng)不同劑量的X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射，24h后收集細胞，Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白Vimentin、N-

4、Cadherin、E-Cadherin。
　　2.X-射線局部照射促進4T1荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移
　　取雌性6周齡 Balb/c小鼠，隨機分為三組，正常對照組，荷瘤組， X-射線照射荷瘤組。小鼠于右側(cè)第四對乳腺脂肪墊接種1×106個4T1細胞，兩周后, X-射線照射荷瘤組的小鼠接受X-射線（20Gy）照射瘤灶，10天后將所有小鼠處死。
　　稱量肺重觀察肺轉(zhuǎn)移情況；取左肺上葉，通過病理切片、HE染色觀察腫瘤肺轉(zhuǎn)移情況；取右肺，

5、機械法分離肺組織提取單細胞懸液，流式細胞術(shù)觀察小鼠肺內(nèi) MDSCs（CD11b+Gr-1+）、巨噬細胞（CD11b+F4/80+）數(shù)。
　　3.X-射線照射的4T1促進4T1-GFP增殖
　　取對數(shù)生長期的4T1細胞，接受0Gy、10Gy、20Gy、30Gy X-射線照射后，用含0.02％EDTA的胰酶消化，每個照射劑量組的細胞調(diào)整細胞密度為3×105個/孔，置于6孔板，每組置3個復(fù)孔。然后每孔加入1×105個4T1-GFP

6、（帶有綠色熒光）細胞，48h后，胰酶消化，收集細胞，每孔細胞加入一個流式管，用流式細胞儀檢測4T1-GFP數(shù)量的百分比。
　　4.X-射線照射后4T1細胞釋放的外泌體對4T1細胞增殖、遷移的影響
　　4.1.外泌體的制備及電鏡觀察
　　收集體外培養(yǎng)4T1細胞及經(jīng)X射線照射后培養(yǎng)72h4T1細胞的培養(yǎng)上清，差速離心法分離提取外泌體：2000rpm，10min；3000rpm，30min；11000rpm；60min；然后

7、將上清超高速100,000×g離心16 h，以少量PBS重懸所得沉淀。最后用磷鎢酸負染外泌體并在透射電鏡下觀察 exosomes的形態(tài)，并以Nanodrop進行定量。
　　4.2.4T1來源的外泌體對體外培養(yǎng)的4T1細胞增殖、遷移能力的影響
　　通過實時無標記細胞分析儀（RTCA）、Transwell細胞遷移實驗觀察不同劑量X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射4T1細胞分泌的外泌體對4T1細胞增殖、遷移能力的

8、影響。
　　4.3.Western blot檢測不同劑量X-射線（0Gy、10Gy、20Gy、30Gy）照射4T1細胞分泌的外泌體刺激4T1細胞對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白Vimentin、N-Cadherin、E-Cadherin的表達。
　　5.X-射線照射后4T1細胞釋放的外泌體對小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響及其可能的機制
　　取雌性6周齡Balb/c小鼠，隨機分為4組，正常對照組、PBS組、4T1/exo組、ir

9、-4T1/exo組。實驗組的小鼠經(jīng)乙醚麻醉，分別經(jīng)鼻吸入PBS、未經(jīng)X-射線照射4T1分泌的外泌體（4T1/exo）、經(jīng)20Gy劑量的X-射線照射4T1分泌的外泌體（ir-4T1/exo），每周3次，每次60μl，連續(xù)3周。三周后將每組小鼠分成2個小組。第一小組：取小鼠肺組織；第二小組：經(jīng)尾靜脈給3個實驗組的小鼠（PBS、4T1/exo和ir-4T1/exo）注射1×105個4T1細胞。
　　稱量肺重觀察肺轉(zhuǎn)移情況；取左肺上葉，通

10、過病理切片、HE染色觀察腫瘤肺轉(zhuǎn)移情況。
　　分別取上述不同處理組的小鼠肺組織（左肺下葉，大約0.037g），用勻漿器進行組織勻漿，ELISA檢測肺勻漿液中細胞因子 CXCL1、IL-1α、G-CSF、IL-10含量。
　　6.X-射線照射前后4T1細胞分泌的外泌體攜帶的細胞因子
　　蛋白芯片技術(shù)檢測 X-射線照射前后（0Gy、20Gy）4T1細胞分泌的外泌體（4T1/exo、ir-4T1/exo）中包含的細胞因子。<

11、br>　　ELISA驗證 X-射線照射前后（0Gy、20Gy）4T1細胞分泌的外泌體中包含的細胞因子。
　　7.外泌體刺激小鼠骨髓巨噬細胞（BMDM）的培養(yǎng)上清對4T1細胞增殖和遷移的影響
　　7.1.BMDM細胞的培養(yǎng)
　　取Balb/c小鼠股骨腔內(nèi)的骨髓細胞，用完全1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入細胞因子GM-CSF刺激7天，終濃度為50ng/ml，刺激3天后補一次刺激因子。
　　7.2.外泌體刺激BMDM細胞48h

12、，收集培養(yǎng)上清，通過實時無標記細胞分析儀（RTCA）、Transwell細胞遷移實驗觀察該上清對4T1細胞增殖、遷移能力的影響。ELISA檢測外泌體刺激BMDM細胞后培養(yǎng)上清中細胞因子CXCL1、IL-1α、G-CSF含量的變化。
　　7.3.外泌體刺激BMDM細胞對M1、M2相關(guān)蛋白表達的影響
　　體外培養(yǎng)BMDM細胞，經(jīng)外泌體刺激48h，收總蛋白，Western blot檢測外泌體刺激BMDM細胞對IKappaB、IKK

13、a表達的影響。
　　7.4.外泌體刺激對BMDM細胞的p38MAPK信號分子的影響
　　體外培養(yǎng)BMDM細胞，經(jīng)外泌體刺激48h，收總蛋白，Western blot檢測外泌體刺激BMDM細胞對細胞信號通路分子p38MAPK、p-p38表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.X-射線照射促進4T1細胞凋亡率明顯增高，與未經(jīng)照射的4T1細胞相比差異顯著（P<0.01），并且20Gy組明顯高于10Gy、30Gy組的凋亡。

14、r>　　2.X-射線可明顯降低荷瘤小鼠原位瘤的重量（P<0.05），但促進肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶增多。流式細胞儀結(jié)果顯示，X-射線使小鼠肺內(nèi)MDSCs細胞、巨噬細胞數(shù)量增多（P<0.01）。
　　3.將4T1-GFP細胞加入經(jīng)X-射線照射的4T1細胞的培養(yǎng)體系中，與未經(jīng)照射或10Gy照射的4T1細胞相比，經(jīng)20Gy或30Gy照射的4T1細胞明顯促進4T1-GFP細胞增殖（均為P<0.05）。
　　4.利用差速離心方法得到4T1細胞分泌的

15、外泌體，通過磷鎢酸負染在透射電子顯微鏡下觀察到直徑約在30-150nm的橢圓形顆粒，中間淡染，邊緣深染。
　　5.實時無標記細胞分析儀、Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，20Gy劑量的X-射線照射4T1細胞分泌的外泌體與未照射組分泌的外泌體相比，可明顯促進4T1細胞增殖與遷移（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示30Gy劑量的X-射線照射4T1細胞分泌的外泌體與其他三組照射劑量組（0Gy、10Gy、20Gy）相比

16、可明顯下調(diào)E-Cadherin表達（P<0.05）。
　　6.荷瘤小鼠肺重結(jié)果顯示，與未吸入外泌體組相比，吸入外泌體的小鼠肺重明顯增加（P<0.01），且ir-4T1/exo較4T1/exo肺重明顯增加（P<0.01）；肺組織病理切片結(jié)果顯示，ir-4T1/exo較4T1/exo促進腫瘤肺轉(zhuǎn)移。ELISA結(jié)果顯示，肺組織勻漿ir-4T1/exo組CXCL1、G-CSF的含量高于4T1/exo組（P<0.01）。
　　7.蛋白

17、芯片技術(shù)結(jié)果顯示，4T1/exo與 ir-4T1/exo相比，細胞因子RANTES、MCP1、CXCL1含量明顯增高（P<0.05）。而ELISA結(jié)果顯示， ir-4T1/exo中CXCL1的含量高于4T1/exo組（P<0.01）。
　　8.實時無標記細胞分析儀、Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示， ir-4T1/exo刺激BMDM細胞的培養(yǎng)上清與4T1/exo組相比可明顯促進4T1細胞的增殖與遷移（P<0.01）。ELIS

18、A結(jié)果顯示，BMDM細胞經(jīng)4T1/exo、ir-4T1/exo刺激后的培養(yǎng)上清中細胞因子CXCL1、G-CSF、IL-1α含量增多（P<0.01）。
　　9.Western blot結(jié)果顯示外泌體作用BMDM細胞后NF-κB IKappaB、IKKa表達無差異；p38 MAPK磷酸化水平增加。
　　結(jié)論：
　　1.X-射線局部照射可促進4T1荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移。
　　2.X-射線照射后4T1細胞釋放的外泌體對4T1體