鼠抗人4-1BBL單克隆抗體制備及其生物學功能的研究.pdf

1、4-1BBL（CD137L）是Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，與其受體4-1BB同為共刺激分子TNF/TNFR超家族中的重要成員。4-1BBL分子表達在各種活化的免疫細胞表面，如：B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、活化的T細胞等免疫細胞，但在未活化的T細胞上不表達。另有研究顯示，在某些腫瘤細胞表面也有4-1BBL分子的表達。4-1BBL的表達與惡性血液病有關：如惡性血液病患者的血清中可溶性4-1BBL（s4-1BBL）含量異常升高；另外，在某些T和B腫

2、瘤細胞系，雖然4-1BBL/4-1BB呈較低的構成性共表達，但4-1BBL/4-1BB信號均可促進白血病細胞增殖并參與白血病細胞耐受抗腫瘤藥物的機制。4-1BBL分子與其受體4-1BB結合后可介導雙向信號。研究表明，兩者相互作用產生的正向信號可促進活化的T細胞增殖，這一過程并不依賴CD28信號；而通過膜4-1BBL傳遞的逆向信號可以抑制活化T細胞增殖并誘導其凋亡；4-1BBL逆向信號還能誘導單核細胞活化，促進其IL-6、IL-8和TNF

3、-α的分泌以及M-CSF的產生，并延長其生存；逆向信號還能刺激CD34+造血干細胞來源的DC成熟等，如4-1BBL逆向信號可以上調DC細胞上CD86、CD83的表達以及IL-12的分泌。因此，4-1BBL/4-1BB介導雙向信號在T淋巴細胞、單核細胞及樹突狀細胞（DC）介導的免疫調節(jié)中發(fā)揮重要的作用。但這種4-1BB/4-1BBL雙向信號在免疫應答和免疫調節(jié)中的作用和確切機理尚待深入研究和全面理解。為此，制各特異性抗人4-1BBL分子單

4、克隆抗體，具備重要的研發(fā)價值。本實驗制備了一株鼠抗人4-1BBL單克隆抗體39A8，能夠識別多種腫瘤細胞株，同時以表達4-1BBL分子的人單核白血病細胞株U937、THP-1及膠質瘤細胞株675321為研究對象，初步研究了單克隆抗體39A8對腫瘤細胞體外生長的影響。本論文共分為兩個部分。
　　 1.鼠抗人4-1BBL單抗的雜交瘤細胞株的制備
　　 以基因轉染細胞L929/4-1BBL作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用

5、B淋巴細胞雜交瘤技術，將免疫小鼠的脾臟和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。以L929/4-1BBL為陽性篩選細胞株，以L929細胞為陰性對照，通過間接免疫熒光標記法對雜交瘤細胞株進行篩選。用有限稀釋法進行陽性雜交瘤的亞克隆化培養(yǎng)。經過多次亞克隆及反復篩選，最終得到一株持續(xù)分泌抗人4-1BBL單克隆抗體的雜交瘤細胞株（39A8），經快速定性試紙法鑒定，39A8的重鏈IgG2a，輕鏈為κ鏈。雜交瘤細胞株經體外連續(xù)

6、傳代培養(yǎng)，液氮凍存半年后復蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。
　　 2．鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的體外生物學特性研究
　　 間接免疫熒光法標記U937、THP-1、Hela、PC-3、Daudi、M231、SHG44等細胞，用流式細胞術分析細胞膜熒光標記百分率和熒光強度。結果顯示，4-1BBL能不同程度地在某些腫瘤細胞株上表達。將不同濃度的4-1BBL單抗分別加入到天然表達4-1BBL分子的U937、THP-1、6753

7、21細胞的培養(yǎng)體系中，分別在培養(yǎng)24h，48h、72h和96h，觀察細胞的生長狀態(tài)、計數細胞數量并繪制生長曲線。研究結果顯示：4-1BBL單抗39A8可促進上述三種細胞的生長與增殖。
　　 綜上所述，本研究成功制備了一株特異性的鼠抗人4-1BBL單克隆抗體，進而鑒定了其生物學特性；利用抗人4-1BBL單抗初步探討了4-1BBL逆向信號對腫瘤細胞的生物學效應。因此，這株功能性鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的成功制備為其以后的生物學功