抗人神經(jīng)菌毛素1 b1b2區(qū)單克隆抗體的制備及其生物學(xué)活性初步研究.pdf

1、神經(jīng)菌毛素1（Neuropilin-1;NRP1）是一種多功能的非酪氨酸激酶受體，其最初作為軸突導(dǎo)向因子3(Semaphorin3，Sema3)的受體，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞的導(dǎo)向以及軸突生長(zhǎng)的功能。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，NRP1在血管內(nèi)皮細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子165(VEGF165)的共受體。NRP1通過其胞外區(qū)b1b2結(jié)構(gòu)域與VEGF165相結(jié)合，顯著提高VEGF165與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受

2、體2(VEGFR2，KDR)的結(jié)合能力，促進(jìn)血管發(fā)育生成。腫瘤部位新生血管及腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的NRP1，能顯著促進(jìn)腫瘤局部血管生成以及腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究顯示，阻斷VEGF165與NRP1的結(jié)合，不僅能直接抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，抑制移植瘤的形成，而且還能抑制腫瘤局部血管生成，間接抑制腫瘤的生長(zhǎng)。由于NRP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起到的病理性促進(jìn)作用，NRP1逐漸成為繼VEGFR后的一個(gè)抗腫瘤治療的新靶標(biāo)。本研究通過基因工程技術(shù)克隆得到

3、人NRP1 b1b2結(jié)構(gòu)域(HuNRP1b1b2) cDNA，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)并純化，將獲得的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)篩選特異性針對(duì)人HuNRP1b1b2（HuNRP1b1b2）的單克隆抗體。該特異性單克隆抗體的獲得將為抗血管生成及靶向抗腫瘤治療提供良好的生物學(xué)材料。
　　一、人神經(jīng)菌毛素1 b1b2區(qū)編碼基因的克隆、表達(dá)
　　利用PCR技術(shù)獲得HuNRP1b1b2編碼基因，將該基因片段克隆到載體質(zhì)粒pCo

4、ldTM TF，獲得重組質(zhì)粒pColdTM TF-HuNRP1b1b2，雙酶切鑒定和測(cè)序分析正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，構(gòu)建重組菌BL21(DE3)(pColdTM TF-HuNRP1b1b2)。16℃下，重組表達(dá)菌經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析，確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。融合蛋白經(jīng)Ni+柱親和層析進(jìn)行純化，純化后的蛋白經(jīng)超濾、濃縮、截留、Buffer交換后獲得濃縮的融合蛋白TF-NRP1b

5、1b2。SDS-PAGE結(jié)果表明IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.4 mM/L，濃縮后的融合蛋白TF-NRP1b1b2濃度為1.0 mg/mL。
　　二、抗人神經(jīng)菌毛素1 b1b2區(qū)單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性分析
　　采用融合蛋白TF-HuNRP1b1b2及標(biāo)簽蛋白TF分別免疫8wk BALB/c小鼠，100 ug/只，共免疫3次，間隔2 wk。首免，將融合蛋白與等量完全弗氏佐劑混合乳化，采用腹部皮下多點(diǎn)注射免疫;二免，將融合蛋

6、白與等量不完全弗氏佐劑混合乳化，采用腹部皮下多點(diǎn)免疫;加強(qiáng)免疫，尾靜脈注射不加佐劑的融合蛋白。3d后，取鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0-Ag-14進(jìn)行細(xì)胞融合。采用間接ELISA及間接免疫熒光兩種方法分別篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。間接ELISA，以融合蛋白TF-HuNRP1 b1b2包板，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株;同時(shí)以TF標(biāo)簽蛋白包板，排除其中的假陽(yáng)性。間接免疫熒光法，固定液固定膜表面高表達(dá)HuNRP1的MDA-MB-231細(xì)胞株，分別以融合蛋白TF-

7、HuNRP1b1b2、標(biāo)簽蛋白TF免疫的小鼠血清作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照，建立間接免疫熒光法。經(jīng)有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，共獲得五株能穩(wěn)定分泌抗HuNRP1b1b2的單克隆抗體(McAbs)細(xì)胞株，分別命名為:3E10、5E9、1D12(間接ELISA)、1A7、4F11（間接免疫熒光）。采用間接ELISA、Western-blot、間接免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等方法對(duì)腹水McAbs的生物學(xué)特異性進(jìn)行分析。腹水McAbs3E10、5

8、E9、1D12、1A7、4F11的ELISA效價(jià)分別為:1∶51200、1∶204800、1∶102400、1∶51200、1∶102400;Ig亞類分別為IgG2a、IgG2a、IgG3、IgM、IgM; Western-blot鑒定表明所得McAbs只與融合蛋白TF-HuNRP1b1b2相結(jié)合，而不與標(biāo)簽蛋白TF或其他菌體蛋白相結(jié)合;間接免疫熒光結(jié)果顯示，McAbs1A7、4F11能與MDA-MB-231、HepG2及HUVEC細(xì)胞

9、表面HuNRP1相結(jié)合，其它三株McAbs則不能;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明McAbs4F11在800倍稀釋、McAbs1A7在400倍稀釋時(shí)仍能與MDA-MB-231具有較高的親和力。
　　三、抗人神經(jīng)菌毛素1 b1b2區(qū)單克隆抗體的初步應(yīng)用
　　采用transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)，分析McAbs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞的遷移影響;采用MTT法分析McAbs對(duì)HUVEC、HepG2、MDA-MB-231細(xì)胞的增殖影響;

10、采matrigel誘導(dǎo)的HUVEC體外成管試驗(yàn)，分析McAbs對(duì)血管生成的影響。transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，McAbs1A7和4F11能有效抑制HUVEC的遷移;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示McAbs1A7和4F11均能抑制HUVEC的增殖，但對(duì)HepG2、MDA-MB-231細(xì)胞增殖無顯著影響;HUVEC細(xì)胞體外成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明McAbs1A7及4F11能夠抑制HUVEC細(xì)胞成管。
　　綜上，本研究成功制備了重組蛋白HuNRP