人細胞色素P450 1A2、2C9、2E1和3A4基因克隆及表達.pdf

1、本課題旨在通過基因克隆和異源表達的方法，獲得由特定基因所表達的重組細胞色素P450藥物代謝酶，為以后的酶活性鑒定和酶代謝功能研究奠定基礎。 1.目的基因的克隆與重組病毒的構建分別以國外獲贈的含有CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因的質粒為模板進行PCR擴增目的基因，同時以人肝細胞cDNA為模板PCR擴增CYP2C9基因。對于CYP1A2和CYP2E1，分別在5’端添加EcoRⅠ酶切位點，3’端添加KpnⅠ酶切位點，對于

2、CYP2C9和CYP3A4，分別在5’端添加SalⅠ酶切位點，3’端添加KpnⅠ酶切位點。將目的基因克隆至pCMV-Myc載體上并進行DNA測序，結果證實已獲得完整正確的目的基因。將經過雙酶切的目的基因片段插入經同樣雙酶切后的pFastBacl轉座載體中，重組質粒轉化入大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞中，轉座后產生重組粘粒DNA(Bacmid)。將該重組粘粒轉染Sf9細胞后，即產生重組桿狀病毒。 2.重組蛋白表達將重組桿狀病毒

3、以0.01-0.1的MOI值感染生長良好的Sf9細胞來擴增重組病毒，使病毒滴度達到108pfu/mL，或更高，然后將重組病毒以MOI值5感染Sf9細胞，表達目的蛋白。收集表達72h后的Sf9細胞，經超聲破碎及離心后得到含重蛋白的溶解液。測定蛋白濃度。 3.重組蛋白表達分析Western Blot結果顯示CYP1A2、CYP2C9重組蛋白分別能與羊抗人CYP1A2、CYP2C9多克隆抗體特異性結合，這表明CYP1A2、CYP2C

4、9基因正確插入表達載體中得到正確表達。SDS-PAGE電泳結果可見CYP1A2、CYP2C9蛋白重組CYP2E1蛋白和重組CYP3A4蛋白表達條帶，表明CYP2E1、CYP3A4基因得到正確表達。 綜上所述，本實驗利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)(Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng))分別表達了人CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4重組酶，其中CYP1A2和CYP2C9經過Western Blot鑒定，結果正確