AMPK信號通路負向調節(jié)熱應激誘導仔豬睪丸支持細胞乳酸分泌.pdf

1、AMP依賴性蛋白激酶（AMP activated protein kinases，AMPK）是一種負責代謝和能量需求的蛋白激酶，激活AMPK可以增強分解代謝（脂肪酸氧化和糖酵解等），而且這一激酶也是細胞響應代謝壓力時調節(jié)細胞內能量穩(wěn)態(tài)的關鍵分子。睪丸支持細胞（Sertoli cells，SCs）的代謝具有“瓦爾堡效應”，即使在氧氣充足的情況下也能通過高速的糖酵解將葡萄糖轉化為乳酸，并產生ATP。睪丸支持細胞分泌的乳酸不僅是生精細胞發(fā)育的

2、首選能量底物，而且在精子形成過程中還具有抗凋亡的作用。豬睪丸支持細胞內乳酸的分泌受到GLUT3（gluco se transporters3，葡萄糖轉運載體3）、LDHA（lactate dehydrogenases A，乳酸脫氫酶A）和MCT1（monocarboxylate transporter1，單羧酸轉運蛋白1）的調控。本試驗室的前期研究發(fā)現熱應激（43℃，30 min）能夠促進支持細胞中乳酸的分泌；越來越多的證據顯示，熱應激

3、改變了多種組織和細胞中AMPK的活性，但是熱應激是否可以通過調節(jié)AMPK活性影響睪丸支持細胞中乳酸生成目前還不清楚。因此，本文首先研究了熱應激處理后仔豬睪丸支持細胞內AMPK活性的變化，然后利用AMPK激活劑和過表達模型分析AMPK在乳酸分泌中的作用，并分析了AMPK對乳酸合成量以及相關蛋白GLUT3、LDHA和MCT1 mRNA和蛋白的表達以及LDH酶活的影響。
　　本研究以3周齡左右的仔豬睪丸作為試驗材料，首先用43℃培養(yǎng)箱對

4、體外培養(yǎng)的支持細胞進行30 min的熱處理，然后將熱處理的細胞放回32℃培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)0 h，3 h，6 h，12 h，24 h和48 h（熱應激后恢復處理），利用RT-PCR檢測乳酸分泌相關基因的表達，運用western blot檢測細胞中AMPK的磷酸化水平和乳酸分泌相關蛋白的表達，收集培養(yǎng)液用乳酸檢測試劑盒進行乳酸分泌量的測定，以確定適宜的恢復時間。在此基礎上，用AMPK的激活劑AICAR或轉染AMP K過表達載體，然后熱處理細

5、胞，利用western blot檢測AMPK的磷酸化水平以及乳酸相關蛋白GLUT3、LDHA、MCT1的蛋白表達，利用LDH酶活檢測試劑盒測定細胞內LDH酶的活性，用RT-PCR檢測AMPK的過表達效率及乳酸分泌相關蛋白的mRNA表達情況。
　　試驗結果如下：
　?。?）熱應激（43℃處理30 min）后，培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞分泌的乳酸量增加，伴隨著恢復時間的延長而增加，在12 h達到最大值，與對照組相比增加了75%（P＜

6、0.01）。
　　（2）熱應激后支持細胞內AMPK磷酸化水平降低，且呈時間依賴性。隨著恢復時間的延長而減少，在12 h降到最低，是對照組的58%（P＜0.01）。隨后又逐漸恢復，在48 h已達到正常水平。
　?。?）AMPK激動劑AICAR(2 mmol/L,2 h)促進了AMPK的磷酸化水平（P＜0.01）；降低了熱應激引起的乳酸分泌量增多和GLUT3、LDHA、MC T1的蛋白和mRNA的表達量增加，下調了熱應激后LDH

7、酶活的增加酶活的增加（P＜0.01）。
　?。?）轉染AMPK過表達載體pcDNA-AMPK能顯著提高AMPK mRNA的表達量，與對照相比增加了2.34倍（P＜0.01）；然而空白載體 pcDNA單獨作用卻對AMPK蛋白和mRNA的表達量并無顯著影響（P＞0.05）。
　　（5）pcDNA-AMPK降低了熱應激引起的乳酸分泌量增多和GLUT3、LDHA、MCT1的蛋白和mRNA的表達量增加以及下調了熱應激后LDH酶活的增加