細(xì)菌右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆與表達.pdf

1、右旋糖酐(dextran)是一種以α(1,6)糖苷鍵為主的葡聚糖,具水溶性,可作為代血漿、金屬離子載體和抗凝結(jié)劑等,在醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)中有廣泛應(yīng)用.右旋糖苷蔗糖酶(EC 2.4.1.5)是一種葡萄糖蔗糖酶(又叫葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Ec 2.4)),能催化蔗糖合成右旋糖酐.主要來源于乳酸菌屬的鏈球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)和一些煙草植物細(xì)胞.天然菌株產(chǎn)酶量低,酶與粘稠的產(chǎn)物形成混和物,不利于酶的分

2、離純化,制約了酶的結(jié)構(gòu)功能研究和產(chǎn)物的應(yīng)用.本研究的目的是通過基因工程手段得到高表達右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌株,從而用于右旋糖苷蔗糖酶結(jié)構(gòu)與功能的研究,為右旋糖酐的生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ). 本研究以腸膜明串珠菌Leuconostoc mesnteroides CGMCC 1.544基因組為模板進行PCR擴增獲得了編碼右旋糖苷蔗糖酶的基因,長約4.5kb,并將它克隆到表達載體pET28a(+)中,進行全基因序列測序,并將重組表達載

3、體pET28a(+)-dsrX轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)中.SDS-PAGE分析表明重組蛋白成功表達,蛋白質(zhì)分子量約為170kDa,BandScan軟件分析其占菌體總蛋白的24.5﹪.本研究優(yōu)化了重組蛋白的表達條件和SDS-PAGE電泳條件.檢測到重組酶活性為8.8U/ml菌液.對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)做了研究,其最適反應(yīng)條件是pH5.4、30℃和底物蔗糖濃度為10﹪.并將重組酶與天然酶的酶學(xué)性質(zhì)做了比較,雖然重組酶在pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定