1、啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件。啟動(dòng)子克隆技術(shù)包括啟動(dòng)子探針質(zhì)粒載體篩選啟動(dòng)子和利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子。
綠色熒光蛋白是從多管水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，它可以在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)射綠光。由于它穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和光物理性質(zhì)，又易于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，近些年作為標(biāo)記物已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。本文以質(zhì)粒pAcGFP為骨架，構(gòu)建以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因的啟動(dòng)子探針載體。用一段約700bp的基因片段插入pA
2、cGFP中取代其上的lac啟動(dòng)子，獲得中間載體pEH+GFP。人工合成一段特異核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)序列插入到pEH+GFP中得到載體pEH+GFP+RBS。最終構(gòu)建成以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因的啟動(dòng)子探針載體pGFP+RBS，并用它從銅綠假單胞菌的總DNA中成功釣出一段具有啟動(dòng)表達(dá)GFP的功能的基因片段，初步分析該片段為組成型啟動(dòng)子。
CspA是大腸桿菌中一種主要的冷激蛋白，近來研究人員對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能和在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的
3、調(diào)控以及mRNA穩(wěn)定性等方面作了大量研究。本文用PCR技術(shù)克隆CspA啟動(dòng)子構(gòu)建包含CspA冷激啟動(dòng)子的低溫表達(dá)載體，用以在低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。以大腸桿菌DNA為模板，用人工合成引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大腸桿菌冷激蛋白CspA的低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子(cold啟動(dòng)子)片段，插入到表達(dá)型質(zhì)粒pET30a(+)的T7啟動(dòng)子片段中，以取代pET30a(+)原有啟動(dòng)子，構(gòu)建低溫誘導(dǎo)表達(dá)型載體pET30a/cold。通過克隆表達(dá)精氨酸脫亞胺基酶(AD