口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1靶向DC-SIGN誘導(dǎo)免疫應(yīng)答效果的研究.pdf

1、口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染引起的偶蹄動(dòng)物共患的一種高度接觸性傳染病，能夠造成重大的經(jīng)濟(jì)損失和不良的政治影響。樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，在形成有效的抗FMDV免疫防御中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。利用靶向DC來提高疫苗的免疫原性，是目前疫苗設(shè)計(jì)中的重要策略之一。

2、r>　　本研究以A型FMDV AF/72毒株為材料，分別利用真核桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1，利用異源雙功能化學(xué)交聯(lián)試劑Sulfo-SMCC和生物素-鏈霉親和素（Streptavidin,SA）交聯(lián)系統(tǒng)將寡糖分子與VP1蛋白連接，以DC-SIGN(DC specific ICAM grabbing nonintegrin)的高親和力配體le(x)寡糖為向?qū)Х肿影邢駾C-SIGN，制備了靶向DC-

3、SIGN的抗原，并將其免疫接種小鼠，考察了其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。
　　1、FMDV VP1基因兩種表達(dá)載體的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá)純化。一是根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子的偏好性對(duì) VP1基因進(jìn)行優(yōu)化合成，并構(gòu)建重組質(zhì)粒 pFastBacTMHTB-VP1。將鑒定正確的重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后收獲重組桿狀病毒rBac-HTB-VP1。經(jīng)Western blotting和間接免疫熒光檢測(cè)，表明VP1在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)，大小約為32 kD

4、a，但表達(dá)量不高。二是克隆VP1基因，與大腸桿菌表達(dá)載體 pET-28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28a-VP1。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定成功后再轉(zhuǎn)化至BL21表達(dá)菌中誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)，可見在30 kDa處有明顯條帶，表明VP1在大腸桿菌中成功表達(dá)，且表達(dá)量明顯高于真核表達(dá)系統(tǒng)。將原核表達(dá)的蛋白純化后通過Western blotting檢測(cè)，具有良好的反應(yīng)原性。
　　2、

5、靶向DC-SIGN的le(x)- VP1抗原的制備。首先利用Sulfo-SMCC異源雙功能交聯(lián)試劑將SA與VP1蛋白連接，通過SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳和Western blotting檢測(cè)證實(shí)SA與VP1蛋白成功交聯(lián)，并經(jīng)ELISA方法證實(shí)SA-VP1復(fù)合物中的SA仍具有與生物素反應(yīng)的功能。然后將SA-VP1復(fù)合物與生物素修飾的le(x)寡糖結(jié)合，獲得由le(x)寡糖介導(dǎo)的靶向DC-SIGN的VP1-le(x)抗原復(fù)合物。
　　

6、3、靶向抗原免疫小鼠以及免疫效果的檢測(cè)。靶向抗原通過弗氏佐劑乳化制成疫苗，并免疫接種小鼠，進(jìn)行免疫原性分析，并將純化的VP1蛋白經(jīng)弗氏佐劑乳化作為陰性對(duì)照，滅活疫苗作為陽性對(duì)照，PBS作為空白對(duì)照。結(jié)果：經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，除PBS組外，其余免疫小鼠均產(chǎn)生較高水平的FMDV特異性抗體；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，與空白組相比，其余小鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞含量均出現(xiàn)不同程度的增多，且脾淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后均增殖明顯；細(xì)胞因子芯片檢測(cè)表