負(fù)載口蹄疫病毒VP1-VP4融合蛋白質(zhì)的樹突狀細(xì)胞啟動的T細(xì)胞應(yīng)答.pdf

1、分類號：墨墨55：魚5窆：魚密級：公玨單位代碼：學(xué)號：100862009490負(fù)載口蹄疫病毒VP1一VP4融合蛋白質(zhì)的樹突狀細(xì)胞啟動的T細(xì)胞應(yīng)答TcellresponsestriggeredbydendriticcellspulsedwithVPlVP4fusionproteinoffootandmouthdiseasevirus學(xué)位申請人：指導(dǎo)教師：學(xué)科專業(yè)：學(xué)位類別：授予單位：答辯日期：李娜王家鑫教授預(yù)防獸醫(yī)學(xué)農(nóng)學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)大學(xué)二

2、。一二年五月二十六日摘要口蹄疫(footandmouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDvirus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄獸所引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。目前本病尚無有效的預(yù)防控制措施。FMDV衣殼由VPl、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中VPl為主要抗原位點(diǎn)，含豐富的T、B抗原表位，VP4雖位于衣殼內(nèi)部，相對比較保守，也富含T抗原表位。實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)MDV野毒株并不感染DCs，但在培養(yǎng)基上馴化的FMDV

3、則可以感染DCs。尤其是被抗體IgG調(diào)理的FMDV，不僅可以感染DCs，導(dǎo)致其抗原提呈功能喪失，而且還造成DCs大量死亡，而當(dāng)DCs負(fù)載滅活FMDV免疫復(fù)合物后卻能夠有效地刺激T細(xì)胞。因此，人們開始重視機(jī)體對FMDV細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制研究。樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DCs)是啟動細(xì)胞免疫應(yīng)答的專職抗原提呈細(xì)胞，可通過巨吞飲、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和吞噬三種方式攝取外源性抗原，經(jīng)過多種抗原提呈途徑啟動細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前尚不清楚DC

4、s攝取FMDV抗原的方式以及DCs負(fù)載FMDV抗原后啟動細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制。本研究以重組質(zhì)粒pUC57VPl為模板，通過PCR方法改變VPl一端的酶切位點(diǎn)，然后通過NcoI和BamHI位點(diǎn)將VPl基因插入到原核表達(dá)載體pET32a()，構(gòu)建pET32aVPl。然后用XhoI和BamH1分別對pBluescriptIISK()VP4和pET32aVPl進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建pET32aVPlVP4。將構(gòu)建的pET32a。VPl一VP4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

5、化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過對誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，根據(jù)SDSPAGE確定目的蛋白的最佳表達(dá)條件，利用載體的HisTag標(biāo)簽和FMDV陽性血清分別進(jìn)行Westemblot鑒定。本研究構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)pET32aVPl一VP4經(jīng)酶切和測序鑒定，證明pET32aVPlVP4構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和誘導(dǎo)條件優(yōu)化，在分子量約為49kD處有一條明顯的蛋白條帶，在IPTG濃度為1mmol／L，30

6、℃誘導(dǎo)后5h時表達(dá)量最大。通過電洗脫純化VPl一VP4融合蛋白質(zhì)?！ㄟ^蛋白酶體抑制劑、溶酶體抑制劑、甘露糖受體抑制劑、清道夫受體抑制劑和巨胞飲抑制劑以不同組合處理骨髓源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)，然后將VPlVP4融合蛋白質(zhì)負(fù)載處理后的BMDCs，與淋巴結(jié)T細(xì)胞共培養(yǎng)，以單獨(dú)的BMDCs組和T細(xì)胞組為對照，在共培養(yǎng)后9、24、48、72和96h，取其共培養(yǎng)上清液，ELISA檢測其中IFN吖和IL4含量。結(jié)果顯示，各組在各個時間點(diǎn)上產(chǎn)生的

7、IL4的含量均顯著低于IFN吖含量。蛋白酶體抑制劑處理組在每個時間點(diǎn)產(chǎn)生的IFNY含量均低于不經(jīng)抑制劑處理試驗(yàn)組，但高于溶酶體抑制劑處理組，說明溶酶體在BMDCs處理提呈VPlVP4融合蛋白抗原的過程中發(fā)揮著更重要的作用。甘露糖受體抑制劑處理組在每個時間點(diǎn)產(chǎn)生的IFN吖含量均高于不經(jīng)抑制劑處理試驗(yàn)組(除24h，P005)，說明甘露糖受體的識別作用對負(fù)載VPlVP4融合蛋白之BMDCs活化T的過程發(fā)揮抑制作用；清道夫受體抑制劑處理組在每個