口蹄疫病毒VP1基因轉(zhuǎn)染樹突狀細胞對T淋巴細胞的活化作用研究.pdf

1、口蹄疫(foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（FMD virus，F(xiàn)MDV）引起偶蹄動物多發(fā)的一種急性、熱性和傳播極為迅速的接觸性傳染病。嚴重危害家畜的生產(chǎn)力和畜產(chǎn)品質(zhì)量，給畜牧業(yè)和進出口貿(mào)易造成較大的經(jīng)濟損失，直接威脅著國際貿(mào)易和國家聲譽及人類食品衛(wèi)生，因而受到人們的普遍關(guān)注。目前，針對預(yù)防口蹄疫疾病的爆發(fā)和流行，多數(shù)發(fā)展中國家主要采用注射滅活病毒疫苗的方法。但滅活疫苗存在滅活不徹底和保護期短等缺點。因

2、此，新型口蹄疫疫苗及免疫策略的研究已成為亟待解決的焦點問題。口蹄疫病毒衣殼由4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1,VP2,VP3,VP4各60個拷貝組成，VP1蛋白又稱1D蛋白，其基因位于基因組的2977-3615，編碼213個氨基酸。早期研究表明，結(jié)構(gòu)蛋白VP1暴露在病毒顆粒的表面，是誘導產(chǎn)生中和抗體的主要成分。
　　 本實驗以質(zhì)粒pMD18-VP1為模板，經(jīng)過EcoRI和HindIII雙酶切鑒定和基因序列測定得到FMDV的VP1基因，對目的基

3、因和真核表達載體pcDNA3.1(+)分別以相同的限制性酶EcoRI和HindIII消化后，經(jīng)T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌DH5α后得到重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后，對重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1進行測序，結(jié)果表明，VP1基因定向克隆到表達載體pcDNA3.1中。將VP1基因與GenBank發(fā)表的序列進行同源性比較，證明本研究所用毒株與Foot-and-mouth disease virus O isolate O/

4、NYOO基因編碼序列(NCBI登陸號分別為AY333431.1)同源性最高，可達100％。結(jié)果證明pcDNA3.1-VP1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。為鑒定pcDNA3.1-VP1基因能否在真核細胞中表達，本研究用重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1轉(zhuǎn)染小鼠的單核細胞源樹突狀細胞(MoDC)，同時用空載體轉(zhuǎn)染MoDC作為陰性對照。Western blot檢測結(jié)果顯示，在分子量約為60kD處有一條明顯的蛋白條帶，而空載體在相應(yīng)位置未見蛋白條帶。為了驗證

5、轉(zhuǎn)染VP1的MoDC能否有效地激活淋巴結(jié)T細胞，本研究用轉(zhuǎn)染VP1的MoDC和淋巴結(jié)T細胞組成共培養(yǎng)體系，以負載了滅活FMDV抗原的MoDC（FMDV+DC）與淋巴結(jié)T細胞作為陽性對照，以單純的MoDC為陰性對照，用ELISA法檢測不同時間點IFN-γ水平變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VP1的MoDC與負載了滅活FMDV的MoDC一樣，均可有效地激活淋巴結(jié)T細胞，但轉(zhuǎn)染VP1基因的MoDC可能激活的是淋巴結(jié)CD8+T細胞，并能誘導其釋放大量的IF