植物乳桿菌中亞硝酸還原酶的研究.pdf

1、食品和飲用水中的亞硝酸鹽污染對(duì)人體健康有很大危害。乳酸菌是人體益生菌，可產(chǎn)亞硝酸還原酶，該酶可以應(yīng)用于控制食品和飲用水中的亞硝酸鹽。本論文利用研究室前期篩選和鑒定的一株具有降解亞硝酸鹽能力的植物乳桿菌，通過(guò)誘變育種和培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)提高菌株的亞硝酸還原酶產(chǎn)量，并對(duì)酶進(jìn)行了分離純化和研究了部分酶學(xué)性質(zhì)。同時(shí)本研究室從植物乳桿菌中克隆一未知基因并構(gòu)建了工程菌，該工程菌產(chǎn)生的重組蛋白具有一定的降解亞硝酸鹽能力，本文對(duì)該重組蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性

2、進(jìn)行了研究。得到如下結(jié)論:
　　 以植物乳桿菌(Lactobacillus phntarum)為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外線誘變篩選得到了突變株D27，其酶活力達(dá)到13.4U/mL，比出發(fā)菌株的酶活力提高了22.9％。再對(duì)L.phntarum D27進(jìn)行亞硝酸鈉誘變處理，獲得突變株DS31，其酶活力為14.3U/mL，比出發(fā)菌株的酶活力提高了6.7％。將DS31傳到第5代，其產(chǎn)酶較穩(wěn)定。進(jìn)一步對(duì)其營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行研究，優(yōu)化的培養(yǎng)基為:葡萄糖

3、:20.97 g/L;牛肉膏:10.19 g/L;大豆蛋白胨:10.19 g/L;無(wú)水乙酸鈉:5.00 g/L;檸檬酸三銨:2.00g/L; K2HPO4·3H2O:2.00 g/L; MgSO4·7H2O:0.60 g/L; MnSO4· H2O:0.27 g/L;吐溫80:1 mL/L。
　　 用超聲波結(jié)合溶菌酶破壁法制備的粗酶液酶活達(dá)到1347.6U/mL，粗酶液經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE52陰離子交換柱層析和葡聚糖凝膠層

4、析后得到了電泳純的亞硝酸還原酶。根據(jù)SDS-PAGE測(cè)定的植物乳桿菌中亞硝酸還原酶亞基分子量約為67.6kDa。酶最適反應(yīng)溫度為35℃，且在65℃條件下保溫6h后酶活仍有52.7％，說(shuō)明該酶耐熱性較好。該酶最適pH為6.0，在pH5.6～7.2范圍內(nèi)較穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mn2+、Cu2+和Ba2+能提高酶活力，其中Cu2+可以顯著提高酶活，相對(duì)酶活達(dá)到了183％;Mg2+、Fe2+和Al3+對(duì)酶活力影響不大。Zn2+、Cd2+和K