植物乳桿菌ZS2058中亞油酸異構(gòu)酶的分離純化及其酶學性質(zhì)的研究.pdf

1、共軛亞油酸(ConjugatedLinoleicAcid，CLA)是亞油酸(LinoleicAcid，LA)衍生的共軛雙烯酸的多種位置與幾何異構(gòu)體的總稱。它具有多種營養(yǎng)和保健功能，如抗癌、抗動脈粥樣化和延緩機體免疫力衰退、減肥等。在共軛亞油酸的各種異構(gòu)體中c9，t11—CLA被認為最具有生物活性。利用乳酸菌進行生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸由于反應條件溫和，產(chǎn)物異構(gòu)體較單一，以及易于操作和控制，成為了當前生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸領(lǐng)域的一個研究熱點。而亞油

2、酸異構(gòu)酶作為乳酸菌生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的一個關(guān)鍵酶，近來也成為了研究的一個焦點。 植物乳桿菌ZS2058是本實驗室從泡菜中篩選到的一株具有亞油酸異構(gòu)酶活性的乳酸菌。采用超聲波破碎和溶菌酶消化相結(jié)合的方法來對植物乳桿菌ZS2058中的亞油酸異構(gòu)酶進行提取，超聲波法提取該亞油酸異構(gòu)酶的最佳條件是：破碎功率400W，破碎時間7.5min(破碎5s，間歇9s)。通過對細胞破碎液進行差速離心分級沉淀，將收集到的不同組分進行酶活檢測，發(fā)現(xiàn)膜沉

3、淀組分中的亞油酸異構(gòu)酶活性占所有組分總酶活的70％。因此，該亞油酸異構(gòu)酶為膜結(jié)合蛋白。又通過研究TritonX-100和NaCl對該亞油酸異構(gòu)酶粗酶液活性的影響，進一步證實了該亞油酸異構(gòu)酶為膜結(jié)合蛋白，而且是一種膜內(nèi)在蛋白。對亞油酸異構(gòu)酶粗酶性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，底物LA濃度對亞油酸異構(gòu)酶活性的影響非常顯著，當亞油酸的濃度高于0.08mg/mL時，亞油酸異構(gòu)酶的活性會受到很明顯的抑制；而加入5％的甘油則能增強粗酶液中亞油酸異構(gòu)酶的穩(wěn)定性。

4、 本文對該亞油酸異構(gòu)酶的分離純化進行了研究。硫酸銨分級沉淀的硫酸銨飽和度適宜取值范圍為20％—50％；陰離子交換層析采用梯度洗脫的方法，當緩沖體系TriS-HCl緩沖液(20mM，1％TritonX-100，5％甘油)的pH值為9.0時，亞油酸異構(gòu)酶在NaCl濃度為0.12M處被洗脫下來，并獲得了較好的純化效果。亞油酸異構(gòu)酶粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、陰離子交換層析和凝膠過濾層析后，得到了電泳純的亞油酸異構(gòu)酶，純化倍數(shù)為8.49倍，比酶

5、活為168.58U/mg。經(jīng)SDS-PAGE分析，該亞油酸異構(gòu)酶的分子量約為66kDa。 本文又對純化后的亞油酸異構(gòu)酶的酶學性質(zhì)進行了研究。研究結(jié)果表明，該亞油酸異構(gòu)酶的最適溫度為35℃，最適pH為5.5；該亞油酸異構(gòu)酶的耐熱性較差；多種金屬離子對亞油酸異構(gòu)酶活性的影響均不顯著；金屬螯合劑EDTA和EGTA對亞油酸異構(gòu)酶活性的影響不顯著；多種輔酶因子對亞油酸異構(gòu)酶活性的影響也不顯著；通過采用Lineweaver—Burk雙倒數(shù)法