重組人卵透明帶ZP3蛋白在畢赤酵母中的表達和純化.pdf

1、　　透明帶(ZP)是哺乳類動物卵細(xì)胞膜外包被的一層特殊的非細(xì)胞結(jié)構(gòu),是精子與卵細(xì)胞識別和結(jié)合的部位。人卵透明帶蛋白ZP3是精卵識別和結(jié)合過程中的初級精子受體,因而成為研究孕前型避孕疫苗的潛在靶抗原。體內(nèi)自身透明帶抗體的存在會導(dǎo)致卵巢功能紊亂、不孕以及流產(chǎn)等病變。透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率還可作為精子功能評價指標(biāo)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,為了得到大量高純度的透明帶抗原進行深入的抗生育疫苗和免疫不孕診斷研究的需要,國內(nèi)外科研人員都紛紛通過基因

2、工程途徑生產(chǎn)透明帶蛋白,并克隆了多種哺乳動物卵透明帶的cDNA,包括人ZP3的cDNA。利用基因重組的方法可在體外較大量生產(chǎn)人卵透明帶ZP3蛋白,為抗生育研究和不育癥的診斷提供可靠且成本低廉的研究蛋白。
　　本實驗根據(jù)人ZP3蛋白編碼第23~第408位氨基酸的cDNA序列,設(shè)計一對引物,正向引物含6個組氨酸基因序列和EcoR Ⅰ酶切位點,反向引物含Not Ⅰ酶切位點；然后進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pPIC9K各自經(jīng)EcoR

3、 Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后,用T4 DNA連接酶連接起來,然后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α；在含氨芐青霉素的LB板上挑取單菌落,用煮沸法快速鑒定陽性轉(zhuǎn)化子,并用雙酶切和測序方法鑒定質(zhì)粒。抽提大量重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒線性化后電打孔導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞,在組氨酸缺陷的MD板上篩選陽性克隆。然后用不同濃度的G418-YPD培養(yǎng)液篩選目的基因多拷貝插入的酵母轉(zhuǎn)化子。再通過小瓶培養(yǎng),SDS-PAGE和Western blotting鑒定選出高表達的的轉(zhuǎn)化菌株。

4、將此菌株在發(fā)酵罐里擴大培養(yǎng),從培養(yǎng)液上清里用親和層析的辦法分離純化人卵透明帶ZP3蛋白。
　　PCR擴增的目的基因片段能重組到載體pPIC9K中,用PCR法快速鑒定陽性克隆,也證實目的基因片段正確插入了載體,測序結(jié)果進一步證實人卵透明帶ZP3蛋白基因成功克隆進了表達載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母后,篩選出多拷貝插入宿主染色體的單克隆,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng),以及SDS-PAGE和Western blotting分析,有一表觀分子量為32~43KD