葡萄糖濃度波動誘導INS-1細胞氧化應激及凋亡的損傷機制的初探.pdf

1、為探討葡萄糖濃度波動對胰島β細胞的毒性效應可能性的機制，本研究采用大鼠胰島細胞瘤系INS-1細胞，將其孵育在波動性高糖環(huán)境中72h，隨即觀察細胞中抗氧化酶和氧化標志物水平的改變以及凋亡相關(guān)蛋白的表達。 本研究包括以下兩部分： 第一章、葡萄糖濃度波動對INS-1細胞磷酸戊糖途徑的影響。 目的：觀察葡萄糖濃度波動對體外培養(yǎng)的INS-1細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、NADPH含量以及氧化應激的改變，初步探討葡萄糖濃度

2、波動對胰島β細胞磷酸戊糖途徑的影響。 對象和方法： 1、以大鼠胰島細胞瘤株INS-1細胞為實驗對象，共干預72小時； 2、實驗共分為六個組： A組：正常對照組（NC組：葡萄糖濃度為5．5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基）； B組：持續(xù)性高濃度葡萄糖組（HG組：葡萄糖濃度為16．7mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基）； C組：葡萄糖濃度波動組（FHG組：葡萄糖濃度為16．7mM的RPMI164

3、0完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時后更換為葡萄糖濃度為5．5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時，每日重復3次，夜間9小時維持在葡萄糖濃度為5．5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）； D組：N-乙酰半胱氨酸抗氧化劑（NAC 1．0mM）+NC組； E組：NAC+HG組；F組：NAC+FHG組。 3、利用熒光探針2，7-二氯氫化熒光素（2'，7'-dichlorodihydro fluorescein，DCFH），在

4、488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長條件下，流式細胞儀檢測各組細胞的平均熒光強度，比較各組細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量。四氮唑藍定量檢測細胞內(nèi)G6PD的活性；分光光度計法測定NADPH含量。 4、實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用析因方差分析；各組內(nèi)均數(shù)比較采用單向方差分析（One-way ANOVA）；多重比較采用LSD法，兩獨立樣本比較采用t檢驗。P<0．05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、R

5、OS產(chǎn)量比較培養(yǎng)72小時后，NC組、HG組、FHG組、NAC+NC組、NAC+HG組、NAC+FHG組的ROS產(chǎn)量分別為（37．767±2．312，86．967±7．968，124．267±10．036，36．697±6．093，60．917±2．612，51．473±3．361），其中HG組和FHG組的ROS產(chǎn)量較NC組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0．01，P<0．01），且FHG組比HG組升高的更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P

6、=0．001）；經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+FHG組的ROS產(chǎn)量有所下降，與FHG組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=11．913，P<0．01）； NAC+HG組的ROS產(chǎn)量下降，與HG相比有明顯的改善（t=5． 381，P=0．006）。 2、各組間G6PD活性比較培養(yǎng)72小時后，NC組、HG組、FHG組、NAC+NC組、NAC+HG組、NAC+FHG組的G6PD活性分別為（1．249±0．030，1．091±0．018，1

7、．033±0．013，1．215±0．099，1．119±0．021，1．213±0．012）。統(tǒng)計分析顯示：與正常對照組相比，HG和FHG組G6PD活性均明顯降低、差異有統(tǒng)計學意義（P<0．01，P<0．01），且FHG組較HG降低的更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P=0．005）；經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，波動高糖組的G6PD活性明顯增高，與FHG組相比有統(tǒng)計學意義（t=-18．114，P<0．01）；而持續(xù)高糖組經(jīng)NAC處理后，G6P

8、D活性得到部分改善，但差異無統(tǒng)計學意義（t=-1．714，P>0．05）。 3、NADPH含量比較NC組、HG組、FHG組、NAC+NC組、NAC+HG組、NAC+FHG組的NADPH含量分別為（0．095±0．05，0．077±0．011，0．059±0．004，0．097±0．005，0．087±0．009，0．093±0．004）。統(tǒng)計分析顯示：與正常對照組相比，HG和FHG組NADPH含量均明顯降低、差異有統(tǒng)計學意義（P

9、<0．05，P<0．01），且FHG組較HG降低的更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0．05）：經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+FHG組的NADPH含量增加，與FHG組相比有統(tǒng)計學意義（t=-10．410，P<0．01）；而NAC+HG組的G6PD活性較HG組有部分改善，但差異無統(tǒng)計學意義（t=-1．304，P>0．05）。 4、相關(guān)性分析ROS產(chǎn)量和G6PD活性、NADPH含量存在顯著性負相關(guān)（r=-0． 849，P<0．01

10、； r=-0．926，P<0．01），G6PD活性和NADPH含量存在顯著性正相關(guān)（r=0． 733，P<0．01） 結(jié)論： 1、葡萄糖濃度波動和持續(xù)性高糖作用下，INS-1細胞中ROS產(chǎn)量顯著增加。提示高糖狀態(tài)下，細胞處于較明顯的氧化應激狀態(tài)； 2、葡萄糖濃度波動組和持續(xù)性高糖組較正常對照組相比，INS-1細胞抗氧化酶G6PD活性明顯下降、還原當量NADPH產(chǎn)生減少。提示磷酸戊糖途徑受抑制可能是造成細胞內(nèi)ROS

11、水平增高的機制之一； 3、葡萄糖濃度波動組較持續(xù)高濃度葡萄糖干預相比，細胞的G6PD活性下降更為明顯，NADPH產(chǎn)生更少，ROS水平升高的更為顯著。提示葡萄糖濃度波動對細胞造成的氧化應激損傷更為劇烈： 4、ROS產(chǎn)量和G6PD活性、NADPH含量存在顯著性負相關(guān)（r=-0． 849，P<0．01；r=-0．926，P<0．01），G6PD活性和NADPH含量存在顯著性正相關(guān)（r=0．733，P<0．01） 5、抗

12、氧化劑NAC可以部分改善氧化應激加劇所造成的損傷，保護胰島β細胞。 第二章、葡萄糖濃度波動對INS-1細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。 目的：探討葡萄糖濃度波動誘導體外培養(yǎng)的INS-1細胞凋亡的機制。 對象和方法： 1、以INS-1為實驗對象；實驗分組同前，每組同時干預72小時； 2、實驗方法：免疫細胞化學法分別觀察Bcl-2/bax蛋白的定位和表達差異。使用Impage-Pro Plus 6．0圖像分析

13、軟件對Bcl-2/Bax的表達進行定量分析，顯微鏡下觀察，胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。每張片子隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（1×400），應用圖像分析軟件測量每個視野下陽性反應的平均光密度，用OD值表示。以O(shè)D數(shù)值的大小反映蛋白表達的多少。 3、實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用析因方差分析；各組內(nèi)均數(shù)比較采用單向方差分析（One-way ANOVA）；多重比較采用LSD法，兩獨立樣本比較采用t檢

14、驗。P<0．05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、抗凋亡蛋白Bcl-2在INS-1細胞的表達情況主要在細胞膜和胞漿中表達；NC組、HG組、FHG組、NAC+NC組、NAC+HG組、NAC+FHG組的OD值分別為（0．195±0．009，0．120±0．016，0．122±0．007，0．187±0．007，0．152±0．011，0．155±0．009）。與正常組比較，HG組和FHG組蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義

15、（P<0．01，P<0．01），但兩組間無明顯差異（P>0．05）。經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+FHG組表達增加，與FHG組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=-4．889，P=0．008）；NAC+HG組表達增加，與HG組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3．717，P<0．05）。 2、促凋亡蛋白Bax在INS-1細胞的表達情況主要在細胞膜和胞漿中表達；NC組、HG組、FHG組、NAC+NC組、NAC+HG組、NAC+FHG組的O

16、D值分別為（0．098±0．017，0．158±0．012，0．162±0．004，0．106±0．015，0．136±0．003，0．132±0．014）。與正常組比較，HG組和FHG組蛋白表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0．001，P=0．001），但兩組間無明顯差異（P>0．05）。經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+FHG組表達降低，與FHG組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=3． 705，P<0．05）；NAC+HG組表達降低，與HG

17、組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=3．051，P<0．05）。 3、相關(guān)性分析：Bcl-2與Bax蛋白表達水平存在顯著性負相關(guān)（r=-0．914，P<0．01），Bcl-2與ROS存在顯著性負相關(guān)（r=-0． 843，P<0．01），Bax與ROS存在顯著性正相關(guān)（r=0．845，P<0．01） 結(jié)論： 1、葡萄糖濃度波動和持續(xù)性高糖干預下，INS-1細胞內(nèi)抗凋亡蛋白bcl-2的表達較正常對照組均明顯降低，促凋亡蛋白