高表達(dá)MicroRNA-126誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景：糖尿病是以外周器官組織對(duì)胰島素反應(yīng)性降低和β細(xì)胞分泌胰島素障礙為特征的代謝性疾病。隨著生活水平和社會(huì)環(huán)境的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年上升。正常β細(xì)胞的胰島素分泌功能存在自反饋調(diào)節(jié)，以促進(jìn)β細(xì)胞水平的胰島素合成和分泌，β細(xì)胞的衰老及凋亡均使胰島素分泌減少，也參與DM2的發(fā)病過程。有報(bào)道胰島素信號(hào)通路可能存在miR-126的作用靶點(diǎn)。但是miR-126能否影響胰島β細(xì)胞凋亡及增殖目前尚不明確，本課題在INS-1細(xì)胞模型過表達(dá)和低表達(dá)

2、miRNA-126，觀察對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡和增殖的影響。
　　方法：1、本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞為模型，將其分別轉(zhuǎn)染40nM的不同miRNA48小時(shí)，人工合成胰島素100nM刺激細(xì)胞12小時(shí)。并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)干擾INS-1細(xì)胞miR-126表達(dá)的效果。2、實(shí)驗(yàn)分為四組：A、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染nonsense segment，NC），B、miR-126過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-126 mimic），C、miR-126低

3、表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor），D、miR-375 mimic（陽性對(duì)照組）3、應(yīng)用流式細(xì)胞儀、MTS等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力變化；電子顯微鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Omi/HtrA2、XIAP和caspase-3的表達(dá)部位，以及利用定量技術(shù)ImagePro-Plus分析軟件測(cè)定上述蛋白熒光強(qiáng)度值；利用Western Blot方法檢測(cè)XIAP蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：1

4、、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示：miR-126在NC、miR-126 mimics、miR-126 inhib itor三組中的相對(duì)表達(dá)量分別為221.45±23.08（n=3）、52.84±15.78（n=3）、10.86±2.52（n=3）。過表達(dá)組miR-126的表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.05），miR-126低表達(dá)顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.05）。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-126 mimic組和mi

5、R-375 mimic組INS-1細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著高于NC組和miR-126 inhibitor組（P<0.05），而miR-126 mimic組凋亡細(xì)胞數(shù)與miR-375 mimic組間無明顯差異（P>0.05），NC組凋亡細(xì)胞數(shù)和miR-126 inhibitor組間無明顯差異（P>0.05）；與之相應(yīng)，MTS法檢測(cè)INS-1細(xì)胞活力顯示：miR-126 mimic組和miR-375 mimic組中細(xì)胞活力明顯下降，低于NC組和mi

6、R-126 inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），miR-126 mimic組細(xì)胞活力與miR-375 mimic組間無明顯差異（P>0.05），NC組細(xì)胞活力和miR-126 inhibitor組間無明顯差異（P>0.05）；
　　3、電鏡下可見：過表達(dá)組眾多INS-1壞死細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核折縫樣改變，染色質(zhì)高度濃縮、邊集；線粒體空泡化改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分與細(xì)胞膜融合，出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象。NC組和低表達(dá)

7、miR-126組偶見壞死細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。
　　4、細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示四組INS-1細(xì)胞均有Omi/HtrA2和caspase-3蛋白表達(dá)，而XIAP蛋白表達(dá)僅限于胞核。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示miR-126mimics組XIAP蛋白表達(dá)量分別明顯低于NC組和miR-126 inhibitor組。
　　結(jié)論：1、過表達(dá)miR-126、miR-375可以誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡；
　　2、過表達(dá)