CDPK31通過(guò)與NIP11互作調(diào)控?cái)M南芥砷吸收的分子機(jī)理的研究.pdf

1、砷污染問(wèn)題在全球范圍內(nèi)普遍存在，中國(guó)也是砷污染最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。人類工業(yè)廢水的直接排放等活動(dòng)造成砷和其他重金屬元素在近海海域和土壤中積累現(xiàn)象也較為普遍。砷污染問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重威脅著沿海等地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境和人畜健康。砷流入人體最主要的途徑之一是通過(guò)食物鏈的傳遞。因此，闡明植物對(duì)砷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝調(diào)控途徑的生物學(xué)機(jī)理對(duì)控制砷在食物鏈的傳遞意義重大。目前，As(Ⅲ)通道活性調(diào)節(jié)機(jī)制還缺乏詳細(xì)文獻(xiàn)報(bào)告。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)NIP1;1的活性調(diào)

2、節(jié)跟植物砷的耐受性密切相關(guān)。本研究以哥倫比亞背景的野生型擬南芥、耐砷突變體nip1;1和蛋白激酶缺失突變體cpk31為研究材料，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)證明了鈣調(diào)蛋白激酶成員CDPK31與NIP1;1之間的互作。突變體cpk31和突變體nip1;1一樣也具有As(Ⅲ)耐受表型，而且突變體cpk31與nip1;1的地上部分和地下部分都比野生型擬南芥積累的砷更少。此外，我們發(fā)現(xiàn)CDPK31的組織表達(dá)模式也與NIP1;1一致，尤其是

3、在根部維管束的表達(dá)幾乎完全一樣。As(Ⅲ)脅迫下CDPK31和NIP1;1的表達(dá)都下調(diào)，因此，CDPK31和NIP1;1很可能是在同一個(gè)代謝通路中。在砷脅迫下，植物很可能通過(guò)下調(diào)CDPK31的表達(dá)來(lái)降低對(duì)NIP1;1的激活，從而減少植物對(duì)砷的吸收和砷由地下部分向地上部分的運(yùn)輸。本研究主要探討Ca2+和CDPK31在砷吸收代謝中的調(diào)控作用。主要結(jié)果如下:
　　1.我們通過(guò)酵母雙雜交的篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)和酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，證明NIP1;1與

4、CDPK31的互作，雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)合亞細(xì)胞定位技術(shù)的結(jié)果也進(jìn)一步證明了NIP1;1與CDPK31在擬南芥原生質(zhì)體的質(zhì)膜發(fā)生互作。
　　2.As(Ⅲ)處理耐砷突變體nip1;1-1，nip1;1-2和蛋白激酶CDPK31缺失突變體cpk31-1、cpk31-2和cpk31-3的表型分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pk31-1、pk31-2和cpk31-3與野生型相比均具有耐砷表型，但比nip1;1-1和nip1;1-2對(duì)砷的耐受性弱，而且雙突變

5、體cpk31-1nip1;1和nip1;1一樣對(duì)As(Ⅲ)耐受性較強(qiáng)。這暗示著蛋白激酶CDPK31可能正調(diào)控NIP1;1的活性。檢測(cè)10μmol·L-1As(Ⅲ)處理不同時(shí)間后的野生型擬南芥(Col-0)、nip1;1-1和cpk31-1突變體中的砷含量發(fā)現(xiàn)，cpk31-1和nip1;1-1突變體一樣在地下部分和地上部分積累的砷更少。同樣的表型和砷積累模式表明CDPK31很可能是NIP1;1的正調(diào)控因子。
　　3.GUS染色結(jié)果顯

6、示:CDPK31的表達(dá)模式與NIP1;1一致，二者都在根部的維管束中的中柱細(xì)胞表達(dá)較多，CDPK31在葉肉細(xì)胞以及氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞上都有表達(dá)，在生殖器官花的萼片、柱頭也有表達(dá)，果莢的頂端基部也有表達(dá)。在NIP1;1表達(dá)的部位CDPK31都有表達(dá)，在花中的表達(dá)說(shuō)明CDPK31可能影響砷在種子中的積累和地下部分到地上部分的長(zhǎng)距離運(yùn)輸。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，10μmol·L-1As(Ⅲ)處理Col-0后，NIP1;1和CDPK

7、31在根部的表達(dá)量都降低，NIP1;1在葉片中的表達(dá)量上升，而NIP1;1和CDPK31在三周大的植株中主要表達(dá)在根部，這意味著擬南芥不僅可以通過(guò)降低NIP1;1的表達(dá)量來(lái)減少As(Ⅲ)的脅迫，同時(shí)也可以通過(guò)降低CDPK31的表達(dá)來(lái)減少CDPK31對(duì)NIP1;1的激活。擬南芥可能優(yōu)先通過(guò)降低CDPK31的表達(dá)這條途徑來(lái)抵抗As(Ⅲ)的脅迫。
　　5.亞細(xì)胞定位技術(shù)分析NIP1;1表達(dá)變化:砷和鈣單獨(dú)或同時(shí)處理擬南芥時(shí)，Ca2+和A

8、s(Ⅲ)同時(shí)處理時(shí)野生型和突變體植株都比只用As(Ⅲ)處理時(shí)長(zhǎng)勢(shì)好，As(Ⅲ)處理mCherry-nip1;1（RFP標(biāo)記NIP1;1基因）擬南芥幼苗后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)NIP1;1在擬南芥根部細(xì)胞中的表部位和表達(dá)量都發(fā)生變化，表達(dá)部位由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜和液泡膜，而且隨著鈣濃度的增加，NIP1;1在質(zhì)膜的表達(dá)先增加后降低。這表明鈣離子可能通過(guò)某種途徑減少NIP1;1的表達(dá)而減少擬南芥對(duì)砷的吸收，從而增強(qiáng)擬南芥對(duì)砷的耐受性。