丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的原核表達(dá)、純化和晶體學(xué)研究.pdf

1、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)是1946年從舊金山海灣的污泥中分離出來的梭狀芽孢桿菌。該菌是革蘭氏陽性厭氧菌。它主要是以α-丙氨酸或β-丙氨酸為碳源和氮源，經(jīng)過一系列的反應(yīng)，最終代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸和二氧化碳。丙酸梭菌體內(nèi)存在著特殊的代謝途徑即非隨機(jī)化的代謝途徑。在這個(gè)代謝途徑中，如果抑制丙烯酰輔酶 A脫氫酶的催化活性，丙烯酰輔酶 A則不能轉(zhuǎn)化成丙酸輔酶A，而是在乳酰輔酶A脫水酶的催化下生成丙烯酸，結(jié)果就導(dǎo)致少

2、量丙烯酸的積累。因此，很多人把丙酸梭菌作為丙烯酸生物合成中重要的菌株來研究。
　　丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Propionate CoA-transferase)是丙酸梭菌代謝過程中催化最后一步反應(yīng)的酶。該酶將丙酰輔酶 A催化生成丙酸，同時(shí)，該酶也能催化乳酰輔酶 A轉(zhuǎn)變成乳酸，參與丙烯酸合成途徑。后也有報(bào)道利用改造的丙酰輔酶 A轉(zhuǎn)移酶合成聚乳酸。目前，輔酶 A轉(zhuǎn)移酶家族已經(jīng)有很多的成員的結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，但目前還沒有關(guān)于該酶的結(jié)構(gòu)報(bào)道。因此我

3、們的研究意義在于解析該酶的晶體結(jié)構(gòu)并研究該酶的功能。
　　在本課題中，我們首先使用 PCR技術(shù)擴(kuò)增丙酸梭菌的丙酰輔酶 A轉(zhuǎn)移酶基因，然后將該基因構(gòu)建到 pET-22b(+)質(zhì)粒載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行該蛋白表達(dá)。接著將收集到的菌液破碎離心后進(jìn)行蛋白純化。純化方法主要為鎳離子親和層析和凝膠過濾層析法。先利用鎳離子親和層析色譜進(jìn)行初步純化，然后使用?KTA FPLC和凝膠過濾層析技術(shù)進(jìn)一步純化，最終獲得高純度均

4、一穩(wěn)定的蛋白。
　　對該蛋白，我們首先做了酶活性檢測。該酶活性檢測是根據(jù)Ellman反應(yīng)進(jìn)行的，檢測出最終產(chǎn)物在412 nm有光吸收，表明該蛋白具有活性。之后我們用商業(yè)結(jié)晶試劑盒對蛋白進(jìn)行晶體的初步篩選，獲得目的蛋白晶體后，用格柵法和商業(yè)晶體添加劑試劑盒等進(jìn)一步優(yōu)化晶體，提高晶體質(zhì)量。同時(shí)，我們也嘗試了進(jìn)行pct蛋白與其底物的復(fù)合物結(jié)晶試驗(yàn)，目前晶體還在優(yōu)化中。
　　本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步確定了 Pct蛋白的純化和結(jié)晶條件，為晶體進(jìn)