兼容CODIS與ESS核心基因座的24個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的構(gòu)建與驗(yàn)證及法庭科學(xué)應(yīng)用的研究.pdf

1、STR（短串聯(lián)重復(fù)）是一種廣泛用于司法實(shí)踐領(lǐng)域且行之有效的遺傳標(biāo)記，為便于數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)及數(shù)據(jù)庫(kù)之間DNA數(shù)據(jù)比較，必須要統(tǒng)一所使用的核心基因座。自從1997年11月以來(lái)，美國(guó)FBI實(shí)驗(yàn)室一直采用13個(gè)STR核心基因座上報(bào)國(guó)家數(shù)據(jù)庫(kù)，這13個(gè)CODIS核心基因座為D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317,D16S539,D18S51,D21S11,FGA,TH01,TPOX,vWA。在歐洲，各個(gè)國(guó)家間也一直在

2、致力于將基因座統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程，2009年4月，歐洲法庭科學(xué)研究機(jī)構(gòu)（ENFSI）一致決定在已有的歐洲標(biāo)準(zhǔn)基因座(ESS)7個(gè)STR(D3S1358，D8S1179，D18S51，D21S11，F(xiàn)GA，TH01，vWA)基礎(chǔ)上，增加了另外5個(gè)STR基因座(D1S1656，D2S441，D10S1248，D12S391，D22S1045)，但是，這并沒(méi)有解決CODIS與ESS兼容的問(wèn)題。目前，CODIS與ESS只有7個(gè)基因座重復(fù)，隨著國(guó)際

3、上各個(gè)國(guó)家之間的交流及DNA數(shù)據(jù)庫(kù)容量的增加，構(gòu)建一套既能便于數(shù)據(jù)共享又能降低隨機(jī)匹配數(shù)的核心基因座，是法庭科學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。
　　本文研究構(gòu)建了一個(gè)新的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，可以同時(shí)熒光檢測(cè)23個(gè)STR基因座與1個(gè)性別基因座，涵蓋了美國(guó)CODIS與歐洲ESS所有核心基因座以及另外5個(gè)商品試劑盒中常用的基因座(D2S1338，D6S1043，D19S433，PentaD，PentaE)。24個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)具有更高的個(gè)體識(shí)別能

4、力，實(shí)現(xiàn)了一次復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)，獲得比其他方法更多的信息含量，滿足了法醫(yī)學(xué)親子鑒定及失蹤人口身源鑒定的需要。對(duì)血痕和口腔拭子打孔取樣，直接擴(kuò)增，且PCR反應(yīng)的整個(gè)時(shí)間少于90分鐘。
　　依據(jù)DNA分析方法科學(xué)工作組(SWGDAM)制訂的確證實(shí)驗(yàn)指南[8]及中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(CNS)“法庭科學(xué)人類STR復(fù)合PCR檢驗(yàn)試劑質(zhì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)”(GA/T815-2009)，從種屬特異性、靈敏性、穩(wěn)定性、精確性與準(zhǔn)確性、案件檢材適用性、遺傳多態(tài)性、混合

5、樣本及PCR方法學(xué)驗(yàn)證等方面進(jìn)行測(cè)試，力求證明該24個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)準(zhǔn)確、可靠、高效，適用于法庭科學(xué)人類個(gè)體識(shí)別。
　　材料與方法：
　　1、依據(jù)①中國(guó)法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)選用的基因座標(biāo)準(zhǔn)(GA469-2004)，②CODIS和ESS核心基因座，③兼容當(dāng)前商品試劑盒的常染色體STR基因座。
　　2、根據(jù)自GenBank(R)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，應(yīng)用Primer3(v.0.4.0)和AutoDimer v1.1軟件設(shè)計(jì)引物并

6、對(duì)所選擇引物進(jìn)行二聚體檢測(cè)，所有熒光染料均標(biāo)記在引物的上游端。
　　3、以pUC18質(zhì)粒為模板，選取927至1425核苷酸位置，擴(kuò)增17個(gè)不同大小的片段，制備分子量?jī)?nèi)標(biāo)。
　　4、以pUC18質(zhì)粒為模板，選取927至1425核苷酸位置，擴(kuò)增5個(gè)不同大小的片段并用不同熒光標(biāo)記，制備Matrix熒光校正品。
　　5、以群體遺傳學(xué)調(diào)查觀察到的不同等位基因個(gè)體DNA為模板，分別擴(kuò)增每個(gè)基因座，擴(kuò)增產(chǎn)物按比例混合、平衡，再以其稀

7、釋液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，制備STR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的等位基因ladder。
　　6、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)靈長(zhǎng)類動(dòng)物（黑猩猩、狒狒、獼猴、狐猴）和非靈長(zhǎng)類常見(jiàn)動(dòng)物（狗、貓、鼠、豬、牛、羊、雞）以及微生物（白色念珠菌、酵母菌、大腸桿菌、糞腸球菌、具核梭桿菌、乳酸桿菌、滕黃微球菌、綠膿桿菌、表皮葡萄球菌、唾液鏈球菌），驗(yàn)證系統(tǒng)的種屬特異性。
　　7、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)稀釋成4ng、2 ng、1 ng、500 pg、250 pg、

8、125 pg、63 pg、32 pg、16 pg、8 pg的9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。
　　8、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)含不同濃度常見(jiàn)抑制因素（血紅素、腐殖酸、EDTA、SDS、乙醇、咖啡、茶、牛奶、醬油、糖、煙蒂），驗(yàn)證系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
　　9、使用176份等位基因ladder樣本，分別在3130xl和3730遺傳分析儀上電泳分析，通過(guò)等位基因ladder中等位基因片段長(zhǎng)度在不同儀器不同run中的平均值和標(biāo)

9、準(zhǔn)差，來(lái)評(píng)估本復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)在3130xl遺傳分析儀及3730 DNA分析儀上進(jìn)行基因分型的準(zhǔn)確性。
　　10、收集46份無(wú)關(guān)個(gè)體血痕樣本，分別在3130xl和3730遺傳分析儀上電泳分析，通過(guò)計(jì)算樣本等位基因片段長(zhǎng)度與等位基因ladder中等位基因片段長(zhǎng)度的差值，來(lái)評(píng)估本復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)在3130xl遺傳分析儀及3730 DNA分析儀上基因分型的精確性。
　　11、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)不同的案件樣本，驗(yàn)證系統(tǒng)的適用性。

10、>　　12、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)、商品化試劑盒（PowerPlex(R) Fusion系統(tǒng)、PowerPlex(R)18D系統(tǒng)、AmpFLSTR(R)SinoFilerTM試劑盒及AmpFLSTR(R) NGMTM試劑盒檢測(cè)美國(guó)國(guó)家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究所DNA分型標(biāo)準(zhǔn)品SRM2391c及群體樣本中的276份，驗(yàn)證系統(tǒng)的一致性。
　　12、2800M與9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品定量后，按照1∶0、9∶1、4∶1、1∶1、1∶4、1∶9、0∶1

11、不同比例混合，使混合后總的DNA模板量為1ng，用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)，驗(yàn)證系統(tǒng)對(duì)混合樣本的檢測(cè)能力。
　　13、用6.25μl、12.5μl、25μl的擴(kuò)增體系，分別對(duì)模板量100 pg、250 pg、500 pg、1 ng的9948 DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的確證。
　　14、用1ng的9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，用于PCR循環(huán)參數(shù)（退火溫度、最后延伸溫度和時(shí)間、循環(huán)次數(shù)）的評(píng)估。STR基因座圖譜

12、的完整性、平均峰高值、均衡性等作為評(píng)價(jià)系統(tǒng)的性能指標(biāo)。
　　15、分別以0.5×，0.75×，1.25×及1.5×PCR組份，檢測(cè)1ng的9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行PCR反應(yīng)成分的確證。
　　16、用群體樣本驗(yàn)證系統(tǒng)的stutter、均衡性與丟峰率。
　　17、應(yīng)用新構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)對(duì)北方漢族547例無(wú)關(guān)個(gè)體血痕樣本進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)分析23個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性及相關(guān)法醫(yī)學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、

13、成功構(gòu)建5色熒光標(biāo)記的24個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，并能在3130xl、3730等遺傳分析儀上應(yīng)用。PCR反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)68分鐘，直接擴(kuò)增血痕與口腔拭子樣本得到完整分型。
　　2、依據(jù)SWGDMA指南和CNS(GA/T815-2009)標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)靈敏度為125 pg～2ng，具有良好的種屬特異性、穩(wěn)定性、精準(zhǔn)性和準(zhǔn)確性，對(duì)案件檢材具有良好的適用性，與商品化試劑盒分型比較呈現(xiàn)完整的一致性，可應(yīng)用于一定范圍內(nèi)的混合樣品分析

14、，對(duì)于反應(yīng)體積、循環(huán)參數(shù)、反應(yīng)成分變化具有一定程度的耐受性，stutter的百分比＜15％，基因座內(nèi)均衡性＞87％、同一熒光標(biāo)記均衡性＞60％、不同熒光標(biāo)記均衡性＞30％，在峰高50RFU、150RFU、450RFU下，丟峰率分別為0.18、0.09、0.01。
　　3、在群體研究中，除CSF1PO、D3S1358、TH01、TPOX外，其余STR基因座均呈高雜合性(He＞0.7)、高個(gè)體識(shí)別能力(DP＞0.9)、高多態(tài)性信息含量

15、(PIC＞0.7)。累積個(gè)體識(shí)別率(TDP)、無(wú)關(guān)個(gè)體偶和概率(TPI)、累積非父排除率(CPE)分別為0.999999999999999999999999999265、7.35×10-28和0.999996847。DNA數(shù)據(jù)庫(kù)隨機(jī)匹配概率，在547個(gè)樣本容量?jī)?nèi)低至1.10×10-22，在中國(guó)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)（容量約1200萬(wàn)）為5.29×10-14。
　　結(jié)論：
　　1、本研究構(gòu)建并驗(yàn)證了5色熒光標(biāo)記的24個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)

16、，聯(lián)合CODIS與ESS核心基因座，極大降低DNA數(shù)據(jù)庫(kù)隨機(jī)匹配人數(shù)，提高數(shù)據(jù)庫(kù)搜索精度;增強(qiáng)數(shù)據(jù)庫(kù)兼容性，便于國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分享;提高了個(gè)體識(shí)別能力，更加適用于失蹤人口身源鑒定。其中9個(gè)基因座擴(kuò)增片段長(zhǎng)度＜200 bp，有助于降解檢材獲得更多的基因分型。復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)和分析均基于現(xiàn)有儀器和軟件，不必進(jìn)行購(gòu)買升級(jí)，節(jié)省成本，更適合于發(fā)展中國(guó)家或者市區(qū)級(jí)地方建庫(kù)的需要。
　　2、本研究構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，PCR時(shí)長(zhǎng)縮短為68分鐘并