循環(huán)血microRNA--10a,--210和--563作為OPLL特異性診斷標(biāo)志物的研究.pdf

1、頸椎后縱韌帶骨化（Ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL）是指頸椎椎體后方因退變或應(yīng)力刺激等原因，導(dǎo)致后縱韌帶異位骨化，進(jìn)而壓迫椎管內(nèi)頸髓，出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的一種疾病，神經(jīng)功能障礙可表現(xiàn)為四肢感覺、運(yùn)動(dòng)異常，伴或不伴隨肌肉萎縮，嚴(yán)重者可因突發(fā)的外力而出現(xiàn)四肢癱瘓、大小便失禁，嚴(yán)重危害人類健康。OPLL發(fā)病具有種群、地域特異性，流行病學(xué)調(diào)查研究表明該疾病在日本、中國(guó)等國(guó)家發(fā)

2、病率居高，最早由日本人報(bào)道，因此該病又稱為“日本病”。文獻(xiàn)報(bào)道該病與內(nèi)分泌激素、機(jī)械應(yīng)力刺激及遺傳因素等多種機(jī)制相關(guān)，單一因素?zé)o法解釋頸椎后縱韌帶骨化癥的發(fā)病機(jī)制。學(xué)者認(rèn)為基因調(diào)控與后縱韌帶骨化發(fā)生密切相關(guān)，因此探索OPLL特異性基因改變并探索其發(fā)病機(jī)制尤為重要。
　　除此之外，頸椎后縱韌帶骨化起病隱匿，無(wú)早期特異性癥狀，缺乏行之有效的早期篩查、診斷方法。OPLL診斷金標(biāo)準(zhǔn)為頸椎CT，該項(xiàng)檢查具有預(yù)約時(shí)間長(zhǎng)，輻射劑量大，價(jià)格昂貴等

3、缺點(diǎn)。CT檢查操作相對(duì)簡(jiǎn)單，掃描速度快，CT薄層掃描可以重建器官、病灶三維影像，方便臨床診斷和治療，大大提高患者生存率，預(yù)后改善明顯。由于以上優(yōu)勢(shì)，自21世紀(jì)至今CT檢查的普及率越來(lái)越高，尤其在我國(guó)基層醫(yī)院使用頻率逐年增加。當(dāng)人們享受這一便利時(shí)，被檢查者接受的輻射劑量也隨之增多，增加了致癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此如何進(jìn)行早期、快速、精準(zhǔn)、無(wú)創(chuàng)的診斷成為目前OPLL又一亟待解決的問題。
　　目前較多文獻(xiàn)報(bào)道后縱韌帶異位骨化與成骨相關(guān)基因表達(dá)密切

4、相關(guān)，其表達(dá)受到上游調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，提示與OPLL的發(fā)生、發(fā)展有重要聯(lián)系。在眾多調(diào)節(jié)機(jī)制中，microRNA(miRNA)起到了至關(guān)重要的作用。miRNA是一類進(jìn)化上高度保守的小分子非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，長(zhǎng)度在18-22nt之間，人體內(nèi)miRNA調(diào)控超過三分之一以上的基因表達(dá)，調(diào)控多種生理病理過程，比如生長(zhǎng)發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等。在腫瘤發(fā)生等領(lǐng)域，有大量實(shí)驗(yàn)分析腫瘤組織及該器官正常組織的miRNA，表明某些特異性m

5、iRNA表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。這一現(xiàn)象提示我們從該角度出發(fā)，探索OPLL的發(fā)病與miRNA的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷和治療之間的關(guān)系。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，篩選出OPLL的特異性miRNA，從而為無(wú)創(chuàng)、高效的診斷OPLL提供新方法、新途徑。
　　第一部分:疾病特異性miRNAs篩選
　　本部分為前期結(jié)果，我們利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選出了OPLL中差異表達(dá)的miRNAs，確定了5個(gè)顯著上調(diào)的miRNAs(miR-10

6、a-3p，miR-10a-5p，563，885-5p，和210-3p)和5個(gè)顯著下調(diào)的miRNAs(miR-129-3p，199b-5p，212-3p，218-3p和196b-5p)。隨后，利用real-time PCR進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了多種miRNAs與OPLL具有較強(qiáng)的相關(guān)性，提示差異表達(dá)的miRNAs可能和OPLL的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。為后續(xù)研究OPLL的特異性生物標(biāo)志物提供了前期基礎(chǔ)和研究OPLL發(fā)病機(jī)制的切入點(diǎn)。
　　第二部

7、分:外周血miRNA的驗(yàn)證及穩(wěn)定性檢測(cè)
　　目的與方法:(1)根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)及臨床癥狀選取5例健康志愿者，并分別采集外周血;(2)通過qPCR驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)所獲取的表達(dá)上調(diào)最顯著的5種miRNA;(3)凍融實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證血清、血漿中miRNA的穩(wěn)定性。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)外周靜脈抽取5例健康志愿者早晨、空腹時(shí)外周血2管（一管為EDTA采血管，用于分離血漿;另一管為普通采血管，用于分離血清）;(2)血清和血漿中均可以檢測(cè)出表達(dá)上調(diào)最顯

8、著的5種miRNA(miR-10a-3p，miR-10a-5p，miR-563， miR-210-3p和miR-885-5p)，并且血清和血漿中miRNA表達(dá)量無(wú)顯著性差異;(3) miR-563，miR-10a-3p和內(nèi)參U6經(jīng)反復(fù)凍融之后表達(dá)無(wú)明顯下降，說(shuō)明其在外界環(huán)境中可穩(wěn)定存在。
　　結(jié)論:我們利用qPCR技術(shù)證明在正常人群外周血中同樣存在多種差異表達(dá)的miRNA，它們?cè)谘搴脱獫{中廣泛存在，均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);除此之外，凍

9、融實(shí)驗(yàn)表明部分miRNA在外界環(huán)境可穩(wěn)定存在，為miRNA成為診斷OPLL特異性生物標(biāo)記物提供可能性。
　　第三部分:外周血OPLL診斷性miRNA的檢測(cè)
　　目的與方法:(1)根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)及臨床癥狀進(jìn)行分組:OPLL組、頸椎間盤退變（Intervertebral disc degeneration，IDD）組、正常對(duì)照組;(2)對(duì)所有入選人員采集外周血;(3) real-time PCR分析入選miRNAs表達(dá)量;(4)

10、三組人群進(jìn)行miRNAs差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;(5)確定診斷OPLL的特異性miRNAs，并進(jìn)行AUC曲線繪制，確定miRNAs診斷特異性。
　　結(jié)果:(1)根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)及臨床癥狀納入OPLL患者68人、IDD患者45人;正常對(duì)照組53人，三組患者年齡、性別等一般參數(shù)無(wú)顯著性差異;(2)經(jīng)外周抽取三組患者早晨、空腹時(shí)外周血（采用EDTA采血管）;(3)MiR-10a-3p、miR-196b-5p和miR-129-2-3p表達(dá)量在O

11、PLL組和非OPLL組具有顯著性差異，在IDD組和OPLL組無(wú)顯著性差異;miR-218-1-3p表達(dá)量在OPLL組和IDD組具有顯著性差異，在OPLL組和正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異;miR-10a-5p，miR-563和miR-210-3p表達(dá)量在三組中均具有顯著性差異。(4) MiR-10a-5p，miR-563和miR-210-3p三種miRNAs聯(lián)合的AUC為0.950。
　　結(jié)論:MiR-10a-5p，miR-563和miR

12、-210-3p在三組患者中表達(dá)量均有顯著性差異，三種miRNAs聯(lián)合的AUC為0.950，說(shuō)明三者聯(lián)合可作為診斷OPLL的特異性生物標(biāo)志物。
　　后縱韌帶骨化癥是一種臨床工作中常見的脊柱韌帶骨化性疾病，為椎體后方后縱韌帶骨化，壓迫后方脊髓，從而產(chǎn)生較重的神經(jīng)功能障礙。該病早期可無(wú)任何癥狀或癥狀較輕，無(wú)特異性;后期脊髓嚴(yán)重受壓時(shí)則會(huì)出現(xiàn)行走障礙或大小便失禁等癥狀。診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)為高分辨率薄層CT，但CT檢查具有輻射性。近幾十年來(lái)，

13、隨著循環(huán)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，越來(lái)越多miRNAs種類得以證實(shí)，功能狀態(tài)相關(guān)研究也越來(lái)越多。目前已經(jīng)證實(shí)miRNAs異常和腫瘤發(fā)生、病毒感染等疾病密切相關(guān)，但是其與脊柱相關(guān)性疾病的關(guān)系尚不明確。針對(duì)上述問題，我們創(chuàng)新性的從microRNAs入手，尋找二者之間的聯(lián)系。利用高通量技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，從后縱韌帶細(xì)胞中篩選出OPLL差異表達(dá)的miRNAs，并通過real-time PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNAs與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。隨后，在

14、OPLL患者外周血中進(jìn)一步驗(yàn)證了血清和血漿中均可以檢測(cè)出表達(dá)上調(diào)最顯著的5種miRNAs(miR-10a-3p，miR-10a-5p，miR-563，miR-210-3p和miR-885-5p)，說(shuō)明miRNAs廣泛存在于外周血中，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并可被檢測(cè)到，為miRNAs成為診斷OPLL特異性生物標(biāo)記物提供可能性。最后，我們對(duì)已篩選的10種miRNAs在不同脊柱疾病中進(jìn)行比較分析，從而界定出OPLL特異性生物標(biāo)志物:miR-10a-5p，