基于微小凹圖式上的神經(jīng)細胞多維培養(yǎng)及功能響應性研究.pdf

1、細胞與基底的相互作用是細胞生物學、生物材料學及組織工程學等領(lǐng)域共同關(guān)注的研究內(nèi)容，利用微加工技術(shù)探尋及模擬組織內(nèi)神經(jīng)細胞在其特定微環(huán)境中的生長行為及功能響應等對于理解體內(nèi)胚胎發(fā)育、神經(jīng)組織再生及修復等具有重要的意義。然而生長在低縱深圖式化結(jié)構(gòu)底部上的細胞同時受底面及側(cè)壁的影響，這些圖式往往并不支持真正的側(cè)壁上三維培養(yǎng)而應被看做近似二維(near two-dimensional,N2D)培養(yǎng)系統(tǒng)，這種在單細胞(single cell)水平

2、上的近似二維培養(yǎng)與側(cè)壁上的三維培養(yǎng)其細胞是否具有相同的功能特性仍是一個待解決的問題。且在以神經(jīng)干細胞(NSCs)聚集體為基礎的干細胞組織工程及微系統(tǒng)構(gòu)建中，其在多細胞水平(multiple cells)上又是如何通過細胞與基底及細胞間的相互作用共同調(diào)節(jié)細胞的生物學響應呢？因此，實現(xiàn)不同水平上的神經(jīng)細胞在圖式化結(jié)構(gòu)基底上的多維培養(yǎng)及原位評價不同培養(yǎng)系統(tǒng)細胞的功能響應與生長行為之間的關(guān)系是構(gòu)建神經(jīng)細胞微系統(tǒng)及組織工程植入體的重要環(huán)節(jié)。

3、>　　本文基于微加工技術(shù)設計并制備出微小凹直徑分別為80μm，100μm，120μm，微小凹深度為100μm，無通道和通道寬度分別為20μm和40μm的PLLA微小凹圖式結(jié)構(gòu)基底，實現(xiàn)了SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞和海馬NSCs在圖式上的復合培養(yǎng)及誘導分化?？疾炝藘煞N水平上的神經(jīng)細胞定向遷移、轉(zhuǎn)化及其影響因素，進而構(gòu)建出神經(jīng)細胞多維培養(yǎng)模型。此外，結(jié)合免疫熒光染色及鈣離子熒光檢測技術(shù)原位評價了該培養(yǎng)模型中細胞的生長行為及功能響應特性

4、，探究了ROCK信號通路及RGK蛋白Gem在細胞生物學響應中的調(diào)節(jié)機制，并構(gòu)建出具有功能性的圖示化神經(jīng)細胞網(wǎng)絡。本研究可應用于神經(jīng)細胞微系統(tǒng)中高通量藥物篩選及靶標響應性的功能評價及組織工程植入體的體外構(gòu)建等。
　　本文的主要內(nèi)容和結(jié)果：
　　(1)設計并制備出PLLA微小凹圖示結(jié)構(gòu)基底，進而構(gòu)建出由微小凹底部受側(cè)壁限制的近似二維細胞(N2D cells)、側(cè)壁上的三維細胞(3D cells)和結(jié)構(gòu)表面的二維細胞(TS-2D

5、cells)組成的SH-SY5Y細胞多維培養(yǎng)模型，并評價了其在單細胞水平上的生長行為及鈣離子功能響應特性。研究發(fā)現(xiàn)微小凹圖示通過誘導N2D細胞在圖示上的定向遷移、轉(zhuǎn)化進而完成其多維培養(yǎng)模型的構(gòu)建，且伴隨著細胞微絲骨架的重排及形態(tài)特征的變化。同時，研究發(fā)現(xiàn)圖式上的細胞(N2D and 3D cells)較平面基底上的細胞(FS-2D cells)表現(xiàn)出形態(tài)鋪展和VGCCs功能響應性的明顯降低，且N2D細胞的相應值均介于FS-2D細胞和3D

6、細胞之間，提示細胞的VGCCs功能響應性與其形態(tài)鋪展具有明顯的相關(guān)性。
　　(2)通過引入ROCK信號通路抑制劑研究了微小凹圖示上SH-SY5Y細胞生長行為及功能響應的調(diào)節(jié)機制。研究發(fā)現(xiàn)微小凹圖式通過抑制ROCK信號通路的活性，進而抑制SH-SY5Y細胞在圖式上的微絲骨架排布、形態(tài)鋪展及黏著斑的裝配；而抑制ROCK信號通路后對細胞在圖式上增殖及遷移的影響具有時間依賴性，且圖式結(jié)構(gòu)基底本身的微環(huán)境因素及細胞形態(tài)、密度等其他因素對其的

7、影響更大。此外，抑制ROCK信號通路后對鋪展形態(tài)較好的FS-2D及N2D細胞其VGCCs功能響應具有抑制作用，而對側(cè)壁上呈球狀的3D細胞反而具有促進作用，這一結(jié)果與其RGK蛋白Gem的表達呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，表明細胞的功能響應與其培養(yǎng)系統(tǒng)及形態(tài)特征密切相關(guān)。
　　(3)在多細胞水平上研究了大鼠海馬NSCs在微小凹圖式上的生長行為及其多維培養(yǎng)模型的構(gòu)建，并評價了圖式上NSCs干細胞特性的保持。研究發(fā)現(xiàn)微小凹圖示上細胞與基底及細胞間的

8、相互作用共同調(diào)節(jié)細胞的定向遷移及微小凹內(nèi)聚集體的形成，從而構(gòu)建出微小凹內(nèi)以三維聚集體方式生長(MW-3D cells)和圖式結(jié)構(gòu)表面以二維貼壁方式生長(TS-2D cells)的NSCs多維培養(yǎng)模型，且無通道微小凹圖式早于有通道微小凹圖式完成其多維培養(yǎng)模型的構(gòu)建。而有通道微小凹內(nèi)更利于其干細胞的長期增殖及干細胞特性的保持，且可用于構(gòu)建準一維排布的神經(jīng)細胞網(wǎng)絡。
　　(4)通過對圖式上海馬NSCs誘導分化以研究其圖式化神經(jīng)細胞網(wǎng)絡的