腦缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡及新生細(xì)胞形成的研究.pdf

1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文腦缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡及新生細(xì)胞形成的研究姓名：邱林申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：朱長(zhǎng)連20060310腦缺氧缺血厲神經(jīng)細(xì)胞步匕亡及新生細(xì)胞形成的研究l O 只，正常對(duì)照組各5 只；2 1 同齡雄性小鼠1 5 只，其中缺氧缺血組l O 只，正常對(duì)照組5 只。方法：1 缺氧缺血腦損傷模型制作：1 ．5 ％一3 ．5 ％安氟醚吸入麻醉，結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后1 h 給予動(dòng)物吸入濕化氮氧混合氣，其濃

2、度和吸入時(shí)| 百J 在7 d大鼠、9 d 小鼠、2 1 d 小鼠不同，分別為7 ．7 ％，5 5 m i n ：l O ％，3 5 m i n ；1 0 ％，3 0 m i n 。2 給藥方法及藥物劑量：B A F 于H I 后2 h 、1 2 h 腦室注射，每次劑量5 p 1 ；H I 后即刻腹腔注射2 一亞氨基生物素，劑量：2 0 m g ／k g ( 1 0 I J 1 ／g ) ；B r d u 于不同組問(wèn)H I 后l d 、1

3、 w 、2 w 開(kāi)始腹腔注射，每次劑量5 0 m g ／k g ，每天一次，連續(xù)七天。3 免疫組化染色：檢測(cè)A I F ，M A P 一2 ，細(xì)胞色素C ，硝基酪氨酸，活性c a s p a s e 一3 ，發(fā)夾寡核苷酸探針( H P P ) 原位雜交，B r d u 。4 免疫熒光染色：檢測(cè)A I F —H P P —H o e c h s t3 3 3 4 2 ，A I F - T U N E L - H o e c h s t3

4、3 3 4 2 ，A I F - 細(xì)胞色素C —H o e c h s t 3 3 3 4 2 ，A I F ～C O X ，A I F —M A P 一2 ，硝基酪氨酸～A I F - H o e c h s t3 3 3 4 2 ，H P P - 硝基酪氨酸- - H o e c h s t 3 3 3 4 2 ，c a s p a s e 一3 一硝基酪氨酸～H o e c h s t 3 3 3 4 2 ，B r u d ～N

5、e u N ，B r d u —A P C ，B r d u —I b M ，B r d u —S I O O B 。5 W e s t e r n 蛋白印跡：檢測(cè)細(xì)胞色素C 、細(xì)胞色素氧化酶I V ( C O X ) 、c a s p a s e 一3 、c a s p a s e 一9 、a ～t u b u l i n ( a 一微管蛋白) 、硝基酪氨酸等蛋白表達(dá)。6C a s p a s e 活性檢測(cè)：檢測(cè)e a s p a s

6、 e 一1 、2 、3 、9 的活性。7 采用激光共聚焦成像技術(shù)鑒別新生細(xì)胞的分化類型。8 細(xì)胞計(jì)數(shù)：高倍視野下在皮層、紋狀體、海馬、丘腦分別計(jì)數(shù)免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞，海馬區(qū)B r d u 陽(yáng)性細(xì)胞采用立體測(cè)量學(xué)系統(tǒng)計(jì)數(shù)。9 腦梗塞體積測(cè)定：采用M i c r oI m a g e 軟件測(cè)量M A P 一2 丟失面積，依據(jù)公式計(jì)算腦梗塞體積。1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：兩組問(wèn)比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用A N O V Ap o s tH o c

7、 檢驗(yàn)，用S t a t V i e w 軟件處理，P < O ．0 5 為有顯著性差異。結(jié)果：缺氧缺血性腦損傷后細(xì)胞死亡機(jī)制的研究1 ．凋亡相關(guān)蛋白在正常腦組織發(fā)育中的變化：腦組織發(fā)育期間，A I F 水平保持不變。線粒體標(biāo)記物即線粒體膜結(jié)合蛋白細(xì)胞色素C 氧化酶( C O X ) 以及細(xì)胞色素C 、c a s p a s e 一9 隨腦組織發(fā)育表達(dá)增高，c a s p a s e 一3 隨腦發(fā)育高峰期的消退而減少。2 ．H I

8、 后A I F 、細(xì)胞色素C 的釋放：眥后即刻A I F 跨膜核轉(zhuǎn)移，H I 后8 h 達(dá)到峰值，細(xì)胞呈凋亡形態(tài)學(xué)改變， A I F 從線粒體的釋放早于早于細(xì)胞色素C 核轉(zhuǎn)移，且A I F 核轉(zhuǎn)移早于D N A 斷裂。3 ．C a s p a s e 廣譜抑制劑對(duì)A I F 的再分布無(wú)作用，說(shuō)明A I F 通過(guò)c a s p a s e 非依賴途徑發(fā)揮作用。4 ．硝基酪氨酸免疫組化結(jié)果： H I 后3 0 r a n ，在損傷側(cè)大腦半球