環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測牛肉中大腸桿菌O157的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、分類號(hào):!墨2Q2:壘密級(jí):公玨單位代碼:學(xué)號(hào):!鯉墨魚2鯉墨12l環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測牛肉中大腸桿菌0157的研究StudyonaloopmediatedisothermalAmplification(LAMP)forthedetectionof‘?!痗herichiacoli0inbe;fleScherichiacoil0I57Inbeel學(xué)位申請(qǐng)人:梁磊指導(dǎo)教師:張偉教授學(xué)科專業(yè):農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程學(xué)位類別:農(nóng)學(xué)

2、碩士授予單位:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期:二。一一年五月二十九日摘要1885年,德國科學(xué)家TEsch撕ch首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌0157:H7,它是引起腹瀉的重要致病菌。大多數(shù)食物中毒都可追溯到牛肉和未消毒的牛奶,而且感劑量小于100個(gè)細(xì)菌即可引起感染。目前對(duì)大腸桿菌0157:H7的檢測方法主要有傳統(tǒng)的常規(guī)培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測方法和以PCR為代表的分子生物學(xué)檢測方法。傳統(tǒng)方法操作繁瑣,檢測時(shí)間長,而且靈敏度較低;免疫學(xué)檢測方法特異性和靈敏度不理想;P

3、CR方法敏感、快速,但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程,難以在基層普及和推廣。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loopmediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù),檢測食品中的大腸桿菌0157:H7,具有靈敏度高,特異性強(qiáng),檢測方法簡便,耗時(shí)短,檢測成本低等特點(diǎn),適宜在基層普及和推廣。本研究針對(duì)大腸桿菌0157:H7(IQCC10102)帕E保守序歹lJ(Genbank$83460),運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(h

4、ttp://primerexplorerjp/e/indexhtml)設(shè)計(jì)LAMP引物。對(duì)BST酶添加量、dNTP濃度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定25“L的LAMP反應(yīng)體系為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各16IxM,外引物(F3和B3)各02laM,環(huán)引物(LB)O8laM,06mMdNTP,30mMMgCl2,10BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,8UBstDNA聚合酶大片段,1肛LDNA模板和滅菌雙蒸水。LAMP反應(yīng)過程是:64

5、℃水浴鍋中反應(yīng)20min,然后將其放入80℃水浴鍋中,水浴10min終止反應(yīng),通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀,判斷是否發(fā)生LAMP反應(yīng)。為了比較LAMP檢測大腸桿菌0157:H7靈敏度和人工污染的檢出限,以PCR方法作對(duì)照。PCR引物是LAMP的兩條外引物(F3和B3)。結(jié)果表明:LAMP檢測大腸桿菌0157:H7的靈敏度為98CFU/mL,人工污染牛肉的檢出限為68CFU/g。PCR檢測大腸桿菌0157:H7的靈敏度為980CFU/

6、mL,人工污染牛肉的檢出限為68x103CFU/g。采用試劑盒法提取DNA,從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,LAMP方法約耗時(shí)2h,PCR方法約耗時(shí)3h。利用LAMP方法對(duì)19株腸道致病菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果表明:三株大腸桿菌0157為陽性,其他16株菌均為陰性。初步研究了3種模板制備方法對(duì)LAMP檢測牛肉中大腸桿菌0157:H7的影響。結(jié)果表明,LAMP方法對(duì)制備模板DNA的要求不高。研究表明:LAMP技術(shù)是一種檢測程序簡單、靈敏度和特異性較高

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