百菌清單克隆抗體的制備及ELISA快速檢測方法的建立.pdf

1、百菌清（CTN）是一種非內(nèi)吸性廣譜有機(jī)氯殺菌劑，它在土壤中經(jīng)光、酶或微生物等作用后轉(zhuǎn)化為羥基百菌清，其毒性和穩(wěn)定性增加，不僅危害到了人的身體健康，還對(duì)環(huán)境造成了污染。相關(guān)的研究可以看到百菌清是一種能使動(dòng)植物細(xì)胞發(fā)生遺傳性突變的化學(xué)物質(zhì)。因此，研究建立快速、靈敏、有效的百菌清殘留檢測方法可以解決很多現(xiàn)實(shí)問題。百菌清殘留免疫學(xué)檢測比其他的檢測方法更加的靈敏和準(zhǔn)確，本研究在分析CTN免疫學(xué)特性的基礎(chǔ)上，運(yùn)用單抗技術(shù)制備了百菌清的單克隆抗體，同

2、時(shí)也獲得了CTN的ELISA試劑盒。主要研究結(jié)果如下：
　　1.CTN人工抗原的制備和鑒定結(jié)果：乙二醇法合成衍生物羥基百菌清（CTN-OH）；羰基二咪唑法合成全抗原CTN-BSA、CTN-OVA，紫外分光光度法（UV）、凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定；用CTN-BSA免疫BALB/c小鼠，之后通過間接ELISA和間接競爭ELISA來測定制備的百菌清多抗的血清的效價(jià)和其敏感性，以此來確定制備的抗體的特性。UV掃描圖譜結(jié)果和SDS-

3、PAGE電泳的結(jié)論可以得知CTN-OH與BSA偶聯(lián)成功。2號(hào)小鼠抗血清的效價(jià)最高，對(duì)CTN的半數(shù)抑制濃度（IC50）為93.593ng/mL，并且與其他競爭物基本沒有交叉反應(yīng)。從CTN抗原的制備實(shí)驗(yàn)中可以看到本實(shí)驗(yàn)制得的百菌清多抗具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.CTN單抗的制備和其免疫學(xué)特性鑒定：使用ELISA方法檢測來獲得效價(jià)高的小白鼠作為實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞融合備用鼠，然后通過雜交瘤技術(shù)制備百菌清單克隆抗體（CTNmAb），并對(duì)其效價(jià)

4、、親和力、敏感性、特異性、亞型進(jìn)行鑒定；篩選出了4A31E8、4A31F4、4A32A10、4A32E2四株敏感特異的雜交瘤細(xì)胞；測得的結(jié)果看出細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)為1:6×102～1:6×103，4A31E8誘生小鼠制作的效價(jià)為1:5.12×105，單抗亞型鑒定為IgG1；CTN單克隆抗體的親和常數(shù)Ka為3.1×1010L/moL，對(duì)CTN的IC50為21.6685ng/mL；與五氯硝基苯的交叉反應(yīng)率為1.98％，與其它競爭物無交叉反應(yīng)

5、。最后獲得的結(jié)果看出制備的CTNmAb的效價(jià)和特異性都很好。
　　3.百菌清ELISA試劑盒的制備：使用ELISA的方法最后得到最優(yōu)的包被抗原濃度為2μg/mL，抗體工作濃度為1:64000，確立了間接競爭ELISA的快速檢測的措施，同時(shí)組裝了百菌清間接競爭的 ELISA快速檢測試劑盒；通過對(duì)制備的試劑盒進(jìn)行活性和性能檢測，得到的數(shù)據(jù)顯示研制的百菌清試劑盒可以用于實(shí)際樣品的檢測，并且獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)很高，達(dá)到了