miR-23a靶定IRF1和PPP2R5E并調(diào)控胃腺癌細胞的增殖和紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡.pdf

1、背景和目的：微小RNA是細胞內(nèi)源性的18-25個核苷酸長度的非編碼小片段RNA家族，通過與其靶基因mRNA的3'UTR互補配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因的表達。許多研究表明miR-23a在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都扮演重要角色。實驗室前期工作證實miR-23a在胃腺癌中表達水平明顯升高，并且篩選出了miR-23a的兩個候選靶基因IRF1和PPP2R5E。IRF1是干擾素調(diào)節(jié)因子家族成員之一，在許多細胞中都有組成型表達。IRF1作用廣泛

2、，通過調(diào)節(jié)一系列基因表達水平，來調(diào)控細胞生長、凋亡等過程。PPP2R5E是蛋白磷酸酶2A，調(diào)節(jié)亞基B家族的成員，屬于B56亞家族。蛋白磷酸酶2A是四種主要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶之一，參與負性調(diào)控細胞的生長和分化。IRF1和PPP2R5E與惡性腫瘤的關(guān)系密切，具有抑癌基因活性。本研究的主要目的是探尋在胃腺癌細胞中miR-23a的直接作用靶基因，闡明miR-23a對其靶基因的調(diào)控機制以及對胃腺癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法：在

3、胃腺癌細胞系中改變miR-23a的表達水平后，應(yīng)用MTT、集落形成實驗和TUNEL實驗檢測miR-23a對細胞增殖及紫杉醇誘導(dǎo)凋亡的影響。在胃腺癌細胞系MGC803和BGC823中過表達或抑制miR-23a水平后，分別檢測IRF1和PPP2R5E在mRNA和蛋白水平上的變化。應(yīng)用實時定量PCR法檢測胃腺癌組織中miR-23a及其候選靶基因的表達水平。應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測胃腺癌組織中IRF1和PPP2R5E的表達水平。在胃腺癌細胞系

4、MGC803和BGC823中，分別應(yīng)用過表達和敲降質(zhì)粒對IRF1和PPP2R5E進行過表達或抑制后，通過實時定量PCR法和蛋白印跡實驗(Western blot)驗證質(zhì)粒有效性。在兩種細胞系中過表達或抑制IRF1和PPP2R5E后，應(yīng)用MTT、細胞集落形成和TUNEL實驗檢測這兩種蛋白對細胞活性、集落形成能力和紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響。最后，通過過表達IRF1和PPP2R5E后，檢測由miR-23a引起的細胞表型變化是否得到減輕或消除

5、。
　　 結(jié)果：在MGC803及BGC823中，miR-23a可以抑制紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡并促進細胞增殖。并且miR-23a能夠在mRNA水平上負性調(diào)控內(nèi)源性IRF1和PPP2R5E的表達，實時定量PCR結(jié)果顯示胃腺癌組織中miR-23a較癌旁組織表達上調(diào)，而IRF1和PPP2R5E mRNA水平表達下調(diào)，二者呈負性關(guān)系。免疫組化結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比，IRF1和PPP2R5E在胃癌中低表達。經(jīng)實時定量PCR法和蛋白印跡實驗

6、(Western blot)驗證，我們構(gòu)建的過表達和敲降質(zhì)粒都是有效的，可以進行下一步的細胞表型實驗。隨后，細胞功能實驗結(jié)果顯示，IRF1和PPP2R5E能夠抑制胃腺癌細胞系MGC803和BGC823細胞的活性、集落形成能力，并能促進細胞凋亡。miR-23a可以促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，并且由過表達miR-23a對細胞惡性表型的影響分別能夠被過表達IRF1和PPP2R5E所減輕或消除。
　　 結(jié)論：在胃腺癌細胞中，miR-23