AC1MMYR2逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、目的:
　　紫杉醇作為一線化療藥物被廣泛應(yīng)用于多種類型癌癥的治療。但最新的研究表明，持續(xù)的紫杉醇治療，有可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散和外滲。MicroRNAs在促進(jìn)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期運(yùn)用miR-21反義寡核苷酸聯(lián)合低劑量紫杉醇可有效提高藥物的治療效果。
　　本研究主要探討紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以及運(yùn)用miR-21小分子抑制劑--AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇對(duì)提高化療藥效和細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響和相關(guān)的分子

2、機(jī)制。
　　方法:
　　1.根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，分析正常組織和腫瘤組織中miR-21和CDK5的表達(dá)水平。利用原位雜交和免疫組化分別檢測(cè)58對(duì)有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中miR-21和CDK5的表達(dá)水平，研究miR-21和CDK5的表達(dá)模式與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　2.采用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87VIII，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置為細(xì)胞對(duì)照組（control組）、低劑量紫杉醇組(0.5μM)和

3、高劑量紫杉醇組(2μM)。Western blot檢測(cè)各組中E-cadherin、β-catenin、vimentin和CDK5的表達(dá)情況。Real-time PCR檢測(cè)各組中miR-21的表達(dá)水平。
　　3.采用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87VIII，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)為control組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組。免疫熒光檢測(cè)侵襲偽足的數(shù)目。Transwell和Wound

4、Healing Assay分別檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　4.采用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87VIII，miR-21小分子抑制劑AC1MMYR2處理細(xì)胞24 h，RNA測(cè)序分析、GO分析及KEGG分析這個(gè)過(guò)程中miR-21下游的靶基因。采用上述兩種細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)設(shè)置為control組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組，Western blot檢測(cè)各組中CDK5、CDK5R

5、AP1和p-FAKSer732的表達(dá)水平。采用上述兩種細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染shCDK5的慢病毒或CDK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，建立CDK5敲除和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)設(shè)置為control組、紫杉醇組和紫杉醇+AC1MMYR2組，Western blot檢測(cè)3種細(xì)胞系中E-cadherin、β-catenin和vimentin的表達(dá)水平。采用人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87VIII，實(shí)驗(yàn)設(shè)置為control組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR

6、2組，免疫熒光檢測(cè) E-cadherin、N-cadherin、β-catenin及Tubulin-α的表達(dá)情況和亞細(xì)胞定位。
　　5.采用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87VIII，實(shí)驗(yàn)分為 control組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組，Western blot檢測(cè) CDK5RAP1、Egr-1和p39的表達(dá)水平。采用上述兩種細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)分為control組、IgG組、AC1MMY

7、R2組和紫杉醇+AC1MMYR2組，免疫共沉淀研究p39和CDK5之間的相互作用。采用上述兩種細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)分為control組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組，免疫熒光檢測(cè)p39在細(xì)胞內(nèi)的分布，Western blot檢測(cè)p39在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平。
　　6.構(gòu)建MDA-MB-231裸鼠乳腺癌原位模型，體內(nèi)研究AC1MMYR2對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。5*106轉(zhuǎn)染luciferase慢病毒的MDA-M

8、B-231細(xì)胞注射到裸鼠乳腺脂肪墊上，建立裸鼠乳腺癌原位模型，小鼠被隨機(jī)分為四組（每組8只）：PBS組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和聯(lián)合治療組。小動(dòng)物活體成像檢測(cè)腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移的熒光信號(hào)。H&E染色鑒定是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。免疫組化檢測(cè)4種治療組中CDK5和β-catenin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，miR-21和CDK5在腫瘤組織中都是高表達(dá)的，且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

9、0.05)。原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織相比，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中miR-21的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在39例侵襲性乳腺癌組織中全部檢測(cè)到CDK5的表達(dá)，但是在19例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，只有7例檢測(cè)到CDK5的表達(dá)。
　　2. Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組相比，低劑量紫杉醇組中E-cadherin的表達(dá)水平升高，β-catenin、vimentin和CDK5的表達(dá)水平顯著

10、降低；高劑量紫杉醇組中E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低，而β-catenin、vimentin和CDK5的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。此外，Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量紫杉醇組中miR-21的表達(dá)水平明顯降低，而高劑量紫杉醇組中miR-21的表達(dá)水平明顯升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.免疫熒光顯示，與control組相比，紫杉醇顯著增加了MDA-MB-231和U87VIII細(xì)胞中侵襲

11、偽足的數(shù)目，MDA-MB-231細(xì)胞中幾乎增加了2~3倍，AC1MMYR2處理后顯著降低了MDA-MB-231和U8VIII細(xì)胞形成侵襲偽足的能力；與紫杉醇處理組相比，紫杉醇+AC1MMYR2組中只形成了很少量的侵襲偽足。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與control組相比，紫杉醇顯著增加了侵襲細(xì)胞的數(shù)目(P<0.05)，AC1MMYR2處理組中侵襲細(xì)胞的數(shù)目明顯降低；與紫杉醇處理組相比，紫杉醇+AC1MMYR2處理組中侵襲細(xì)胞的數(shù)目降低

12、大約45％~55%。Wound Healing Assay結(jié)果顯示，與control組相比，紫杉醇促進(jìn)了兩種細(xì)胞的遷移能力，而 AC1MMYR2組中細(xì)胞的遷移能力受到了抑制；與紫杉醇處理組相比，紫杉醇+AC1MMYR2組中細(xì)胞的定向遷移受到了明顯的抑制。
　　4.根據(jù)RNA測(cè)序分析、GO分析和KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)只有CDK5RAP1（CDK5調(diào)節(jié)亞基相關(guān)蛋白1）是MDA-MB-231和U87VIII細(xì)胞中miR-21共同的靶基因

13、。Western blot顯示，與control組相比，紫杉醇顯著增加了CDK5及其下游靶p-FAKSer732的表達(dá)水平(P<0.05)；AC1MMYR2和AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇組中這兩種蛋白的表達(dá)都明顯減少(P<0.05)，但 CDK5RAP1的表達(dá)卻顯著升高(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，shRNA介導(dǎo)的CDK5的沉默增強(qiáng)了E-cadherin的表達(dá)水平，與control組細(xì)胞相比，紫杉醇組和聯(lián)合組中間質(zhì)標(biāo)

14、志物β-catenin和vimentin的表達(dá)水平顯著降低；相反，在轉(zhuǎn)染CDK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的兩種細(xì)胞系中，CDK5的過(guò)表達(dá)阻斷了AC1MMYR2的作用，AC1MMYR2組和聯(lián)合組中E-cadherin的表達(dá)減少(P<0.05)，β-catenin和vimentin的表達(dá)增加(P<0.05)。此外，U87VIII細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 control組相比，紫杉醇處理組中幾乎檢測(cè)不到E-cadherin的表達(dá)，β-catenin和N-

15、cadherin的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與紫杉醇處理組相比，聯(lián)合組中E-cadherin的熒光強(qiáng)度增加，β-catenin的熒光強(qiáng)度降低，在細(xì)胞核中的分布減少，N-cadherin的熒光強(qiáng)度也降低；此外，與 control組相比，紫杉醇處理組中Tubulin-α的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，Tubulin-α變得舒展，聚集在核周；與紫杉醇組相比，AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇組中Tubulin-α的熒光強(qiáng)度明顯降低，Tubulin-α變得卷曲。
　

16、　5. Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，AC1MMYR2和聯(lián)合組中隨著CDK5表達(dá)量的降低，CDK5RAP1和Egr-1的表達(dá)顯著提高，而p39的表達(dá)量卻減少。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在 control組細(xì)胞中 CDK5與 p39相結(jié)合，而AC1MMYR2組和聯(lián)合組中 CDK5與 p39之間的結(jié)合減少。免疫熒光顯示，與control組相比，AC1MMYR2組和聯(lián)合組中p39的熒光強(qiáng)度降低，p39在細(xì)胞核中的分布減少

17、，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞漿。Western blot發(fā)現(xiàn)，與control組相比，細(xì)胞漿中p39表達(dá)水平降低，細(xì)胞質(zhì)中p39表達(dá)水平也降低。
　　6.建立MDA-MB-231乳腺癌裸鼠原位模型。小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，與control組相比，紫杉醇治療組在一定程度上抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，AC1MMYR2治療組顯著的抑制了腫瘤的生長(zhǎng)；與紫杉醇治療組相比，AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。治療過(guò)程中對(duì)腫瘤體積的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與control

18、組相比，紫杉醇治療組在一定程度上抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，AC1MMYR2治療組顯著的抑制了腫瘤的生長(zhǎng)；與紫杉醇治療組相比，AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。肺部生物發(fā)光檢測(cè)結(jié)果表明，與control組相比，紫杉醇治療組增加了肺轉(zhuǎn)移，AC1MMYR2治療組沒有肺轉(zhuǎn)移；與紫杉醇治療組相比，AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇治療組顯著抑制了腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。H&E染色也得到了同樣的結(jié)果。免疫組化發(fā)現(xiàn)，與control組相比，紫杉醇治療組中CDK5

19、和β-catenin的表達(dá)水平明顯升高，AC1MMYR2組中這兩種蛋白的表達(dá)水平顯著降低；與紫杉醇治療組相比，聯(lián)合組中CDK5和β-catenin的表達(dá)水平顯著降低。
　　結(jié)論:
　　紫杉醇通過(guò)激活miR-21/CDK5信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，miR-21的小分子抑制劑AC1MMYR2通過(guò)抑制miR-21/CDK5RAP1/CDK5信號(hào)通路的活性，逆轉(zhuǎn)紫杉醇藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為臨床紫杉醇治療的潛在輔助給藥方案，為增