構(gòu)建登革病毒NS1抗原拓?fù)鋱D及建立ELISPOT微中和試驗(yàn)快速高通量評(píng)價(jià)登革病毒抗體中和活性.pdf

1、登革病毒（denguevirus，DENV）屬于黃病毒科(Flavivirade)黃病毒屬（Flavivirus），主要的傳播途徑是通過蚊蟲叮咬敏感的脊椎動(dòng)物宿主。DENV根據(jù)血清抗原反應(yīng)分可為四個(gè)血清型，分別為DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4型。各型病毒感染后均可引起的癥狀主要有登革熱(denguefever，DF)、登革出血熱(denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克綜合征(dengue

2、shocksyndrome,DSS)。
　　 登革病毒的傳播在早期較為局限，主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)。但隨著世界經(jīng)濟(jì)的一體化和各國(guó)之間的交流增強(qiáng)，登革病毒的傳播范圍日益擴(kuò)大，目前在非洲、美洲、東南亞和西大平洋地區(qū)一百多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均出現(xiàn)過登革病毒的流行。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全世界每年約有0.5-1億人感染登革病毒，出現(xiàn)登革出血熱癥狀的嚴(yán)重病例達(dá)50萬(wàn)人，2-2.5萬(wàn)人死亡，其中大多為兒童，死亡率為5％。因此，登革病毒的感染已成為全球重要

3、的公共衛(wèi)生問題，如何有效控制感染是解決這一問題的關(guān)鍵。
　　 人體在感染登革病毒后，可以無(wú)癥狀，也可只出現(xiàn)類似感冒癥狀，可自愈，稍重的是出現(xiàn)DF癥狀，這些病例主要出現(xiàn)在初次感染的患者，兒童患者多需要住院治療。有相當(dāng)部分二次感染的患者可以出現(xiàn)嚴(yán)重的病癥DHF/DSS。目前還沒有一個(gè)特異性的治療方法，患者只能對(duì)癥治療，也缺乏有效的疫苗來(lái)防止感染。根據(jù)目前的研究結(jié)果顯示，出現(xiàn)DHF和DSS的主要原因是抗體依賴增強(qiáng)(antibody-d

4、ependentinhancment，ADE)效應(yīng)，而其根源是登革病毒存在四個(gè)不同的血清型。研究認(rèn)為，病人感染其中一型病毒后，免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生眾多對(duì)各種血清型病毒有交叉反應(yīng)的抗體，這些抗體短期內(nèi)有一定的交叉保護(hù)性作用，但并不具有長(zhǎng)期保護(hù)性作用。相反的，這些與其他血清型病毒有交叉反應(yīng)性的非中和抗體或者是一些亞中和濃度抗體可能就是引起DHF/DSS的重要原因。這些抗體與病毒顆粒結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合后，不能阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，而其Fc部分會(huì)與某些細(xì)胞（如

5、單核細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞）膜上的Fc受體結(jié)合，這種結(jié)合有助于登革熱病毒進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)病毒的攝取及病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，導(dǎo)致感染的增強(qiáng)，從而促使登革的嚴(yán)重疾病的發(fā)生。對(duì)于防止登革疾病傳播的疫苗研發(fā)中，如果僅對(duì)一型病毒進(jìn)行抗感染保護(hù)，會(huì)在病人感染異型病毒時(shí)，產(chǎn)生的ADE效應(yīng)將會(huì)影響病人的生命。因此，各種類型的疫苗是否是引起ADE效應(yīng)是登革防疫研究中一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。
　　 登革病毒從首次分離至今，已有六十余年，但對(duì)其感染后疾病的防治還存在

6、較大困難。其中的最大障礙是對(duì)登革病毒感染后的機(jī)體免疫機(jī)制不明，研究的針對(duì)性不能集中。登革病毒的基因組結(jié)構(gòu)是單股正鏈RNA分子，長(zhǎng)約11000nt，編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為衣殼蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)，七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structureprotein，NS），分別為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。結(jié)構(gòu)蛋白中的E蛋白與病毒感染有關(guān)，主要是與靶細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，參與病毒與細(xì)胞之間的

7、膜融合。在非結(jié)構(gòu)蛋白中，雖然它們并不是成熟病毒顆粒的組成成份，但從目前的研究成果看來(lái)，它們?cè)诓《靖腥九c機(jī)體的免疫過程中起重要的作用。其中特別受到重視的是NS1蛋白，它是登革病毒中主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，通常有三個(gè)形式存在，一為分泌型，可以直接由感染的細(xì)胞分泌到胞外，可用于登革病毒早期診斷指標(biāo)。二為胞內(nèi)型，主要存在于細(xì)胞內(nèi)生物腔膜上，三為膜型，存在于感染細(xì)胞膜上，它的功能推測(cè)可以通過細(xì)胞毒作用，直接參與病毒的清除，另外，也可能在病毒RNA的復(fù)制

8、中起一定作用，但因?yàn)閷?duì)其的蛋白結(jié)構(gòu)未完成了解，與抗體的結(jié)合形式不清楚，所以其真正功能還需進(jìn)一步研究。在抗原蛋白的結(jié)構(gòu)未完全闡明之前，可以利用各種技術(shù)分析預(yù)測(cè)它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如冷凍電鏡、酵母展示、點(diǎn)突變和多肽結(jié)合位點(diǎn)分析等。本研究利用合成的NS1重疊多肽與148株NS1單克隆抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，可以得到單抗的線性結(jié)合位點(diǎn)。依據(jù)這些單抗的結(jié)合位點(diǎn)的特性，如一個(gè)單抗與多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，表明這些位點(diǎn)的物理位置是相近的，從而可以構(gòu)建出NS1抗原蛋白的拓

9、撲圖。同時(shí)，我們也用流式細(xì)胞術(shù)，篩查各抗體與感染后細(xì)胞的表達(dá)的NS1蛋白抗原的結(jié)合類型，了解有哪些抗體是可以與感染細(xì)胞膜表面抗原進(jìn)行結(jié)合的，從而可以為解釋NS1蛋白在登革病毒感染免疫機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 疫苗是一個(gè)有效預(yù)防感染性疾病的方式。如前所述，登革病毒存在四個(gè)不同的血清型，病人在二次感染異型病毒時(shí)，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的疾病，因此，疫苗的研制除了要有良好的中和保護(hù)作用外，還必須驗(yàn)證是否存在ADE效應(yīng)。從目前的研究來(lái)看，無(wú)論是

10、單一價(jià)的疫苗或多價(jià)疫苗，能同時(shí)符合這兩個(gè)要求的疫苗還沒有面世。在疫苗的研究中，中和實(shí)驗(yàn)是病毒研究中應(yīng)用相當(dāng)普遍的技術(shù)。傳統(tǒng)的方法是蝕斑減少中和實(shí)驗(yàn)(plaquereducingneutralizationtest，PRNT)，但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)結(jié)果的判斷較為主觀，許多研究者在開發(fā)一些可以替代它的方法。包括有基于流式細(xì)胞術(shù)的方法、基于ELISA技術(shù)的方法等。這些方法雖然是可以省時(shí)省力，但也存在一些問題，如病毒用量遠(yuǎn)比PRNT大。另外，

11、在實(shí)際應(yīng)用中，并不是所有的病毒特別是一些臨床分離株，重復(fù)性較差。新近有研究者結(jié)合前期開發(fā)主要用于原位檢測(cè)細(xì)胞因子分泌的技術(shù)一-基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析(enzyme-linkedimmunospot-basedmicroneutralizationassay,ELISPOT)的微中和實(shí)驗(yàn)。本研究將從實(shí)際應(yīng)用出發(fā)，建立和評(píng)價(jià)這一種技術(shù)，并應(yīng)用這一方法檢測(cè)臨床收集的29例1型登革病毒感染患者恢復(fù)期血清的中和效價(jià)。
　　 本研究共分為如下

12、三個(gè)部分:
　　 第一部分:分析登革病毒NS1抗體結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建NS1拓?fù)鋱D
　　 登革病毒NS1蛋白在登革病毒感染后免疫機(jī)制中的作用越來(lái)越受到重視，主要原因是它不是病毒顆粒的組成成份，可以避免引起ADE效應(yīng)。它有多種表達(dá)形式，其中在感染細(xì)胞膜表面表達(dá)的部分，研究認(rèn)為可能介導(dǎo)細(xì)胞殺傷功能而在病毒清除中起重要作用。研究結(jié)果顯示，NS1蛋白應(yīng)有三個(gè)區(qū)域，分別為RⅠ、RⅡ和RⅢ，但因其結(jié)構(gòu)尚未解晰，對(duì)于它的真正分區(qū)功能未能從理論

13、或?qū)嶒?yàn)中得到充分的證明。本研究合成DENV-1NS1的重疊多肽（每條多肽與上一多肽重疊5個(gè)氨基酸，最后一條重疊8個(gè)氨基酸，共35條），檢測(cè)它們與148株NS1單克隆抗體的結(jié)合情況，分析它們的結(jié)合位點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果表明，148株抗體中，有82株抗體可以與多肽進(jìn)行結(jié)合，其中有七株抗體具有結(jié)合兩個(gè)區(qū)域，具體為1A11A9、2E8A5與RⅠ區(qū)的1肽和RⅡ22肽結(jié)合，6D14A4與RⅠ區(qū)的1肽、14肽和RⅡ區(qū)的22肽結(jié)合，1F32A1與RⅠ區(qū)的1肽和

14、RⅡ區(qū)的31肽結(jié)合，7E1A4和7E9A2與RⅠ區(qū)的5肽和RⅢ區(qū)的27肽結(jié)合，1B7A1與RⅡ區(qū)的22肽和RⅢ區(qū)的32肽結(jié)合，三個(gè)區(qū)域相互之間有密切連接位點(diǎn)。利用以上多肽結(jié)合的位點(diǎn)，根據(jù)單抗結(jié)合位點(diǎn)在物理位置上的相近性，我們構(gòu)建出NS1抗原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖。另外，研究證明WNV的NS1抗體可以通過抗體依賴細(xì)胞殺傷功能對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行吞噬清除，其基礎(chǔ)是此抗體須與N在細(xì)胞表面表達(dá)NS1進(jìn)行結(jié)合。我們用流式細(xì)胞術(shù)分析了以上148株抗體與感染

15、病毒后細(xì)胞膜表面的NS1蛋白結(jié)合情況。結(jié)果顯示，分別有92株、87株、75株和91株抗體與同型病毒感染后細(xì)胞膜表面的NS1蛋白結(jié)合。按照單抗與多肽的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果，針對(duì)RⅡ區(qū)結(jié)合的單抗，有82％(18/22)的抗體可以與DENV1-4任一型或多型病毒感染后細(xì)胞膜上抗原結(jié)合，而針對(duì)結(jié)合RⅠ和RⅢ的抗體，分別有60％(29/48)和54％(6/11)的抗體可與膜抗原結(jié)合。這一結(jié)合模式可能與膜型NS1蛋白在感染細(xì)胞膜上嵌合形式有關(guān)。我們的研究結(jié)

16、果與前期對(duì)黃病毒NS1的研究數(shù)據(jù)基本一致。這些數(shù)據(jù)可為研究NS1的功能和NS1抗體應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 第二部分:酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微中和實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)登革病毒抗體中和活性方法的建立與評(píng)價(jià)
　　 目前中和實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)方法是PRNT方法，這一方法在六孔板中進(jìn)行，在病毒感染細(xì)胞后，需要在7-10天的時(shí)間孵育來(lái)形成可以用于檢測(cè)的蝕斑。如果要完成大量的中和實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，這一方法將相當(dāng)耗時(shí)而且結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)。微中和實(shí)驗(yàn)是一個(gè)應(yīng)用較多的高

17、通量檢測(cè)方法，這些實(shí)驗(yàn)是在96孔板中完成。本研究將評(píng)價(jià)一個(gè)新近開發(fā)的基于ELISPOT技術(shù)的微中和實(shí)驗(yàn)方法，并建立用于檢測(cè)抗體或血清對(duì)登革病毒的中和活性的方法學(xué)。按照該法的基本原理是病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞表面可在較短時(shí)間內(nèi)表達(dá)NS1蛋白，將細(xì)胞固定處理后，利用抗NS1的抗體可以建立ELISA檢測(cè)方法，最后用固體原位顯色方法可以通過斑點(diǎn)的形成指示病毒對(duì)細(xì)胞的感染情況。選用VEROE6細(xì)胞為病毒感染的靶細(xì)胞，通過對(duì)病毒加入量和登革各型病毒在感

18、染后的孵育時(shí)間的條件優(yōu)化，建立了ELISPOT方法檢測(cè)登革各型病毒的方法學(xué)。方法學(xué)建立后，我們對(duì)33株抗登革病毒EDⅢ單克隆抗體針對(duì)四個(gè)血清型的中和活性檢測(cè)，然后再?gòu)闹羞x擇十株單抗進(jìn)行PRNT檢測(cè)它們針對(duì)各型病毒的中和活性，兩種檢測(cè)方法應(yīng)用相同病毒株、抗體稀釋梯度進(jìn)行，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示，基于ELISPOT方法可以在96孔板中加入200PFUs病毒的情況下，形成的斑點(diǎn)清晰可辨，登革病毒四個(gè)血清型有不同的感染后孵育時(shí)間，D

19、ENV-1為4天，DENV-2和DENV-4為2天，DENV-3為3天。對(duì)比兩種方法，它們之間的相關(guān)性較好，r=0.863，P＜0.001;如果以PRNT方法為標(biāo)準(zhǔn)，我們將其結(jié)果與ELISPOT方法結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(McNemar)，結(jié)果顯示ELISPOT與PRNT結(jié)果無(wú)顯著性差別（P＜1.000）。ELISPOT微中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這10株單抗針對(duì)四型登革病毒的中和效價(jià)的敏感性和特異性分別為95.6％(22/23)and88.24％(15/

20、17)。如此可見，基于ELISPOT的微中和實(shí)驗(yàn)可以應(yīng)用于四型登革病毒的中和活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，而且這種方法省時(shí)省力，適合進(jìn)行批量篩查。
　　 第三部分:Ⅰ型登革病毒感染患者康復(fù)期血清中和效價(jià)分析
　　 對(duì)登革病毒引起的疾病目前還未有特異高效的治療方法或藥物，因目前也沒有一個(gè)能良好復(fù)制登革病毒感染后癥狀的動(dòng)物模型，使疫苗的研制存在一定的困難。人體在自然感染登革病毒后，免疫狀態(tài)的維持可以從一個(gè)側(cè)面了解機(jī)體的抗病毒機(jī)制。本研究收集

21、了29例在2006年感染1登革病毒的患者恢復(fù)期血清（2010年獲取），利用本實(shí)驗(yàn)室建立和評(píng)價(jià)的ELISPOT微中和實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)它們針對(duì)四型登革病毒的中和效價(jià)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，大部分血清對(duì)四型病毒有交叉中和活性，對(duì)四型登革病毒的中和效價(jià)（IC50，血清稀釋度倒數(shù)）進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruska-WallisH），結(jié)果顯示，四組中和活性有顯著性差異(x2=21.134,P＜0.001)，其中對(duì)同型(DENV-1)的中和活性最高，

22、對(duì)DENV-4的中和活性最低。結(jié)果表明，機(jī)體在感染一種血清型病毒后，對(duì)四型病毒均有可能存在一定的四型交叉中和活性，但對(duì)同型病毒的中和活性強(qiáng)，而對(duì)其他型病的中和活性較弱。這些弱中和活性的交叉抗體，可能會(huì)在機(jī)體受二次異型病毒感染時(shí)引起ADE效應(yīng)。
　　 小結(jié):
　　 綜上所述，本研究在以下方面取得成果:
　　 1、我們合成DENV-1NS1的重疊多肽35條，與148株NS1單克隆抗體進(jìn)行結(jié)合，分析它們的結(jié)合位點(diǎn)，有七

23、株抗體的結(jié)合位點(diǎn)在不同的兩個(gè)區(qū)域，根據(jù)這些位點(diǎn)的物理位置相近性，成功構(gòu)建出NS1蛋白抗原結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖，結(jié)果與前期對(duì)黃病毒NS1蛋白的研究結(jié)果一致。研究結(jié)果可以在蛋白結(jié)晶之前增加對(duì)它基本結(jié)構(gòu)的了解。我們還應(yīng)用流式分析術(shù)，篩查了148株單抗與感染細(xì)胞膜型NS1抗原結(jié)合情況，得到抗體對(duì)各型病毒感染分泌于膜上NS1抗原的結(jié)合模式。結(jié)果顯示，分別有92、87、75和91株抗體與同型病毒感染后細(xì)胞膜表面的NS1蛋白結(jié)合，針對(duì)RⅡ區(qū)結(jié)合的單抗，

24、有82％的抗體可以與DENV1-4任一型或多型病毒感染后細(xì)胞膜上抗原結(jié)合(18/22)，而針對(duì)結(jié)合RⅠ和RⅢ的抗體，有60％(29/48)和54％(6/11)的抗體可與膜抗原結(jié)合，這些結(jié)合模式可能與NS1蛋白在感染細(xì)胞膜上的嵌合模式有關(guān)。
　　 2、建立了基于ELISPOT技術(shù)的微中和實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)平臺(tái)，可以為登革病毒和其他相關(guān)病毒提供快速高通量的中和效價(jià)測(cè)定支撐。同時(shí)，我們也對(duì)此方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)比PRNT方法，方法的特異性和敏感