登革病毒初次感染患者循環(huán)登革病毒NS1抗原和抗體的動(dòng)力學(xué)分析以及非標(biāo)記技術(shù)對(duì)NS1單克隆抗體親和力的測(cè)定.pdf

1、登革熱是一種由登革病毒(DengueVirus，DENV)引起的蟲(chóng)媒傳染病，通過(guò)蚊子（以埃及伊蚊和白紋伊蚊為主）的叮咬在人群中傳播。人類(lèi)感染DENV后將產(chǎn)生從輕到重的很大范圍的臨床癥候群。盡管絕大多登革熱患者顯示為一種類(lèi)似流感樣的自限性疾病，如登革熱(DengueFever，DF)，然而患者的病情有可能發(fā)展到重癥登革熱，如登革出血熱(DengueHemorrhageFever,DHF)或登革休克綜合征(DengueShockSyndro

2、me，DSS)。在未能得到及時(shí)、有效治療的情況下，重癥登革熱將對(duì)患者的生命造成巨大的威脅。
　　 目前，登革熱被認(rèn)為是世界上最為關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其原因主要在于該病的發(fā)病率高，流行范圍廣，并且缺乏行之有效的防治方法。近50年來(lái)，盡管全世界在登革熱的防治方面做了很多的努力，但是登革熱的發(fā)病率還是呈現(xiàn)出急劇上升的趨勢(shì)，給流行國(guó)家的衛(wèi)生防控體系以及患者的家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 DENV屬于黃病毒科，黃病毒屬，是一種

3、有包膜的單股正鏈的RNA病毒，基因組大約11kb長(zhǎng)，包含一個(gè)開(kāi)放性的閱讀框，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。三種結(jié)構(gòu)蛋白分別是衣殼蛋白(capsidprotein，C)，膜蛋白(membraneprotein，M)和包膜蛋白(envelopeprotein，E)。7種非結(jié)構(gòu)蛋白依次為NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。根據(jù)不同的E蛋白基因序列，DENV可被劃分為四種血清型，DENV-1～4。各種DENV的血

4、清型之間存在60-70％的同源序列。DENV的初次感染可以產(chǎn)生針對(duì)感染血清型的終生免疫保護(hù)反應(yīng)，但對(duì)其它三型DENV僅有短暫而微弱的交叉免疫保護(hù)作用。當(dāng)二次感染的血清型不同于初次感染的血清型時(shí)，患者體內(nèi)存在的非中和交叉反應(yīng)性抗體或亞中和濃度的中和抗體可促進(jìn)DENV進(jìn)入Fc受體容受細(xì)胞，增加病毒的復(fù)制，容易導(dǎo)致嚴(yán)重的DHF/DSS的發(fā)生。
　　 迄今為止，登革熱的防治仍缺乏有效的疫苗和抗病毒治療方法，由此登革熱的防治在很大程度上依

5、賴于對(duì)登革熱進(jìn)行早期、快速、精確的診斷。目前登革熱的診斷有三個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)，登革熱病毒的分離與鑒定、RT-PCR以及血清學(xué)診斷。盡管這三種方法在登革熱的診斷中發(fā)揮著不可替代的作用，但是每種方法都存在自身的缺陷，例如登革熱病毒分離和鑒定需要的時(shí)間長(zhǎng)，假陰性率高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的要求高;RT-PCR不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)人員的要求高，而且設(shè)備昂貴，難以推廣;另外，登革熱感染后，患者往往需要一定的時(shí)間才能出現(xiàn)抗體反應(yīng)，而且登革熱與

6、黃病毒的抗體之間存在廣泛的交叉，因此血清學(xué)方法雖然簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，但是不能進(jìn)行早期診斷，而且可能因?yàn)榇嬖邳S病毒之間的交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。由此，建立一種簡(jiǎn)單、方便、早期、快速、精確、經(jīng)濟(jì)的診斷方法仍是登革熱研究中亟待解決的問(wèn)題。
　　 NS1蛋白是DENV中一種保守的糖蛋白，在感染的早期即可在血清中檢測(cè)到高濃度的存在，并與登革熱疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。近10余年來(lái)，各種形式的以NS1抗原捕獲為基礎(chǔ)的免疫分析法得以建立并商品化。

7、這些NS1抗原檢測(cè)方法都具有早期、快速、特異、價(jià)廉、易于操作等特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)NS1抗體的精心選擇而建立的血清學(xué)特異性的NS1抗原抗捕獲ELISA甚至具有血清分型的作用，因此，以NS1抗原為靶標(biāo)的免疫分析法在登革熱的診斷中具有重要作用。然而，NS1蛋白在登革熱感染的不同時(shí)期血清中的分布情況仍不甚明了。對(duì)于NS1蛋白動(dòng)力學(xué)的充分揭示有助于分析NS1抗原檢測(cè)在登革熱診斷中的意義和作用。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，我們用雜交瘤技術(shù)制備

8、了一組抗DENVNS1單抗，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)(immunofluorescenceassay，IFA)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(westernblot，WB)對(duì)這些單抗的免疫反應(yīng)性進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)這些單抗的優(yōu)化配對(duì)，建立了高度敏感和特異的四種血清型特異性的NS1抗原捕獲ELISA，以及一種DENV群特異性的NS1抗原捕獲ELISA。在本研究中

9、，利用DENV-1特異性的NS1抗原捕獲ELISA，我們動(dòng)態(tài)分析了NS1抗原在DENV-1初次感染患者不同發(fā)病時(shí)期血清中的分布情況，結(jié)合DENVIgM和IgG抗體的檢測(cè)，揭示了抗原抗體的聯(lián)合檢測(cè)在登革熱診斷中的作用。
　　 DENVNS1抗原的檢測(cè)不僅在登革熱的診斷中具有很大的優(yōu)勢(shì)，而且，基于NS1抗原檢測(cè)ELISA還具有DENV病毒滴定的作用。此外，利用NS1抗原檢測(cè)ELISA，在本研究中，我們還建立了一種DENV抗體檢測(cè)的微

10、中和試驗(yàn)。結(jié)合商品化的DENVIgM和IgG抗體捕獲ELISA，本實(shí)驗(yàn)室自制的DENVE蛋白Ⅲ區(qū)(EDⅢ)IgG抗體捕獲ELISA，我們對(duì)來(lái)自同一組DENV-1初次感染患者在發(fā)病期和3年后的隨診期血清中的中和抗體、DENVIgM和IgG抗體，EDⅢIgG抗體進(jìn)行了檢測(cè)和比較，揭示了隨時(shí)間的變化DENV患者體內(nèi)抗體水平的動(dòng)態(tài)變化情況，并為登革熱的流行病學(xué)調(diào)查以及登革熱疫苗有效性的驗(yàn)證提供了可能更為有效的檢測(cè)手段。
　　 盡管NS1

11、抗原檢測(cè)的ELISA方法在登革熱的診斷中具有很好的敏感性，但這種方法的操作還是略嫌復(fù)雜。登革熱快速診斷用的膠體金法仍是許多臨床醫(yī)生和研究者的目標(biāo)，但現(xiàn)有的NS1捕獲的膠體金法仍缺乏足夠的敏感性。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)NS1抗原捕獲ELISA的檢測(cè)極限可達(dá)1:5120的血清稀釋度，提示這種方法中采用的單抗具有很高的親和力，但這些ELISA方法中使用的高親和力NS1單抗并不適合膠體金法。為開(kāi)發(fā)高度敏感的登革熱快速診斷的膠體金法，需要對(duì)NS1

12、單抗親和力進(jìn)行詳細(xì)的分析。在本研究中，我們采用了非標(biāo)記技術(shù)，共振波導(dǎo)光柵(ResonantWaveguideGrating，RWG)和表面等離激元(SurfacePlasmonResonance，SPR)，對(duì)大量NS1單抗的親和力進(jìn)行了篩選，從而為NS1檢測(cè)的膠體金法提供了詳細(xì)的抗原抗體相互作用的動(dòng)力學(xué)信息。
　　 由此，本研究分為以下三個(gè)方面的內(nèi)容:
　　 第一部分:DENV-1初次感染患者血中NS1抗原和IgM和Ig

13、G抗體動(dòng)態(tài)分布分析
　　 登革熱NS1抗原檢測(cè)和血清學(xué)分析是登革熱診斷中最為經(jīng)濟(jì)、有效的方法，在登革熱的診斷中具有非常重要的地位。在本研究中，我們用自制的DENV-1特異性的NS1抗原捕獲ELISA，結(jié)合商品化的IgM和IgG抗體捕獲ELISA，對(duì)廣州2006年DENV-1初次感染的確診患者在發(fā)病當(dāng)天到發(fā)病27天的血清標(biāo)本中的NS1抗原和IgM、IgG抗體在動(dòng)態(tài)分布規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病的當(dāng)天，87.5％的患者血中即可

14、檢出陽(yáng)性的NS1蛋白，在發(fā)病的第1到第7天，也就是整個(gè)登革熱病程的急性期，NS1的陽(yáng)性檢測(cè)率在81.8％～91.1％之間的高水平檢測(cè)率范圍內(nèi)波動(dòng)。而到了發(fā)病的第8到14天，也就是疾病的恢復(fù)早期，這種NS1檢測(cè)的敏感性呈現(xiàn)出明顯的下降，到發(fā)病的第14天后，也就是疾病的恢復(fù)晚期，NS1無(wú)法測(cè)到。與NS1抗原分布不同，IgM和IgG抗體分別在發(fā)病的第3和第5天才開(kāi)始在血中顯現(xiàn)，并出現(xiàn)檢出率的逐漸升高。其中IgM抗體較IgG抗體不僅出現(xiàn)更早，而

15、且上升的速度更快，在發(fā)病的第8天，IgM的檢測(cè)達(dá)到檢測(cè)高峰的100％，而IgG抗體則在發(fā)病的第15天才達(dá)到檢測(cè)的高峰(100％)。NS1抗原和IgM抗體在血中的分布呈現(xiàn)一種相反的互補(bǔ)規(guī)律，當(dāng)用兩者方法進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，可大大提高登革熱診斷的敏感性、縮短檢測(cè)的窗口期、延長(zhǎng)檢測(cè)的時(shí)限。表現(xiàn)為在兩者的檢出開(kāi)始出現(xiàn)交叉的第3天一直到恢復(fù)期，聯(lián)合診斷的陽(yáng)性率可高達(dá)96.6-100％，明顯高于單獨(dú)的NS1抗原或IgM抗體檢測(cè)的敏感性。研究表明，登革熱

16、NS1抗原和IgM、IgG抗體的聯(lián)合檢測(cè)為不同感染時(shí)期的初次感染患者提供了一個(gè)較為理想的登革熱診斷方案，這種方案基本上可以滿足對(duì)登革熱進(jìn)行簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速、有效的診斷要求。
　　 第二部分:1型登革病毒初次感染患者急性期和康復(fù)期血清學(xué)動(dòng)態(tài)分析
　　 登革熱患者血清中抗體的檢測(cè)不僅對(duì)登革熱的診斷，而且在登革熱流行病學(xué)調(diào)查以及疫苗有效性的驗(yàn)證等方面具有重要作用，但登革熱感染后，各種抗體隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化情況尚未得到充分闡明，而

17、且現(xiàn)有的登革熱抗體檢測(cè)方法仍無(wú)法充分滿足臨床和研究的需要。在本研究中，利用DENVNS1抗原捕獲ELISA，我們建立了一種DENV中和抗體檢測(cè)的微中和試驗(yàn)，結(jié)合商品化的PanbioIgM和IgG抗體捕獲ELISA，以及自制的抗登革熱EDⅢIgG抗體捕獲ELISA對(duì)DENV-1初次感染患者在發(fā)病期以及3年余后隨診期的血清標(biāo)本進(jìn)行了DENV相關(guān)抗體的檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，登革熱特異性的IgM和IgG抗體的檢出率隨時(shí)間的推移而發(fā)生下降，但抗EDⅢI

18、gG抗體的檢出率隨時(shí)間的推移在體內(nèi)繼續(xù)保持著穩(wěn)定的檢出率。在隨診期，抗EDⅢIgG抗體捕獲ELISA對(duì)血清標(biāo)本檢測(cè)的敏感性顯著高于PanbioIgG抗體捕獲ELISA。這一結(jié)果不僅提示了EDⅢIgGELISA是一種更為敏感的抗體檢測(cè)方法，而且EDⅢIgG抗體在體內(nèi)的穩(wěn)定檢出率還提示了EDⅢ蛋白在登革熱的免疫發(fā)病機(jī)制中可能存在重要作用。而微中和實(shí)驗(yàn)顯示，發(fā)病期血清的中和抗體在四型DENV中具有很強(qiáng)的交叉中和活性，但隨時(shí)間的推移，異型中和抗

19、體滴度出現(xiàn)下降，或者是持續(xù)維持著一個(gè)低水平，而同型中和抗體則隨時(shí)間推移出現(xiàn)滴度的上升，到隨診期，血清中同型中和抗體成為了最具優(yōu)勢(shì)的中和抗體。但本研究未能顯示EDⅢIgG抗體與中和抗體之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性。本研究不僅揭示了登革熱感染后，各種抗體隨時(shí)間的變化而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律，而且表明，本研究室自制的抗登革熱EDⅢIgG抗體捕獲ELISA，以及基于NS1抗原ELISA的微中和實(shí)驗(yàn)可能是登革熱診斷和流行病學(xué)調(diào)查的有效的檢測(cè)工具，盡管其有

20、效性仍需要通過(guò)對(duì)更大樣本的進(jìn)一步檢測(cè)而得證實(shí)。
　　 第三部分:共振波導(dǎo)光柵和表面等離激元技術(shù)對(duì)登革熱NS1單抗與NS1蛋白親和力的鑒定與比較
　　 盡管我們建立的DENVNS1ELISA具有較好的敏感性和特異性，但是這些NS1ELISA中所采用的抗體并不適用于膠體金法?；贒ENVNS1抗原檢測(cè)的膠體金法是一種DENV的快速診斷方法，可以作為床邊診斷(bedsidediagnosis)以及現(xiàn)場(chǎng)、出入境的快速篩查，是DE

21、NV診斷的研究熱點(diǎn)。為尋找膠體金法NS1抗原檢測(cè)法適合的單抗，在本研究中，我們采用兩種免標(biāo)記(non-labeled)技術(shù)，共振波導(dǎo)光柵(ResonantWaveguideGrating，RWG)和表面等離激元(SurfacePlasmonResonance，SPR)對(duì)DENVNS1單抗與NS1蛋白的親和性進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。在前期利用免疫標(biāo)記技術(shù)獲得的DENVNS1mAbs的免疫反應(yīng)性的基礎(chǔ)上，我們選出了80株，55株，75株和64株

22、分別針對(duì)DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4NS1的反應(yīng)性單抗。先用RWG這種高通量的免標(biāo)記技術(shù)對(duì)這些單抗在飽和結(jié)合狀態(tài)下的親和力進(jìn)行了初篩。結(jié)果顯示，這些抗體的親和力的范圍在10nM-1mM之間。隨后用SPR對(duì)這些抗體與抗原相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)分析。SPR方法的檢測(cè)不僅可以提供NS1單抗與NS1蛋白的親和力，也就是平衡解離常數(shù)(equilibriumdissociationconstant，KD)，而

23、且可以進(jìn)一步提供兩者之間的結(jié)合常數(shù)(associationconstant，Ka)及解離常數(shù)(dissociationconstant，Kd)，以及代表NS1單抗對(duì)NS1蛋白可及性（accessibility）的單抗活性百分?jǐn)?shù)。在本研究中，用SPR得出NS1單抗的親和力范圍位于1nM～100nM之間，這些單抗同時(shí)也是RWG方法檢測(cè)到的高、中親和力的單抗(KD=10nM～100nM)，但絕大部分抗體在SPR中顯現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)性。SPR檢測(cè)出的

24、NS1單抗的Ka和Kd則分別波動(dòng)在103到105Ms-1之間和10-7到10-2S-1之間。而DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4NS1反應(yīng)性的單抗的活性百分?jǐn)?shù)則分別波動(dòng)在1.6％-47.2％，2.5％-70.3％，1.0％-26.2％和0.9％-27.2％之間。除DENV-4NS1反應(yīng)性單抗外，在RWG所測(cè)得的高親和力(KD=10nM)單抗，其在SPR中測(cè)得的活性百分?jǐn)?shù)顯著高于RWG測(cè)得為中等親和力（KD=100nM

25、）的單抗。研究表明，免標(biāo)記的RWG和SPR技術(shù)是檢測(cè)分子之間相互作用的親和力的有效工具。當(dāng)對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行篩查時(shí)，可先用高通量的RWG可以對(duì)大量的抗體初篩，排除低親和力和低活性百分?jǐn)?shù)的標(biāo)本，然后用SPR對(duì)高親和力和高活性百分?jǐn)?shù)的抗體進(jìn)行進(jìn)一步動(dòng)力學(xué)分析。根據(jù)SPR的檢測(cè)結(jié)果，一些具有高結(jié)合常數(shù)的NS1單抗可作為膠體金的NS1抗原檢測(cè)方法中的檢測(cè)和捕獲抗體，盡管其有效性仍需要得到進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　 小結(jié):
　　 通過(guò)以上三

26、部分的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究的具有以下三個(gè)創(chuàng)新之處，其中包括:
　　 一、利用我們建立的DENV-1特異性NS1抗原捕獲ELISA和商品化的PanbioIgM和IgG抗體捕獲ELISA，觀察了DENV-1初次感染確診患者從發(fā)病的第1天到第27天血清中NS1抗原和IgM、IgG抗體水平的動(dòng)態(tài)變化情況。首次揭示了登革初次感染患者DENVNS1抗原和IgM抗體互補(bǔ)的消長(zhǎng)規(guī)律，提示了NS1抗原檢測(cè)在急性期以及IgM抗體檢測(cè)在恢復(fù)早期登革熱

27、診斷中的作用，而這兩種方法的聯(lián)合檢測(cè)，不僅可以大大提高登革熱診斷的敏感性，而且可以縮短登革熱診斷的“窗口期”，延長(zhǎng)登革熱診斷的時(shí)限。
　　 二、在本研究中，通過(guò)對(duì)同一組患者在發(fā)病期和隨診期血清中各種抗體動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，登革熱特異性的IgM和IgG抗體的檢出率隨時(shí)間的推移發(fā)生衰退，而抗EDⅢIgG抗體隨時(shí)間的推移依然保持著穩(wěn)定的檢出率，提示自制的DENVEDⅢIgG抗體捕獲ELISA有可能是一種有效的登革熱血清流行病學(xué)調(diào)查的工具。而

28、基于NS1抗原檢測(cè)的微中和實(shí)驗(yàn)對(duì)系列血清中的中和抗體檢測(cè)提示，發(fā)病期血清的中和抗體在四型DENV中具有更強(qiáng)的交叉中和活性，但異型中和抗體滴度隨時(shí)間的推移出現(xiàn)下降，或者是一直維持著一個(gè)低水平，而同型中和抗體隨時(shí)間推移則出現(xiàn)上升，并逐漸顯示為優(yōu)勢(shì)的抗體中和效價(jià)。本研究不僅揭示了登革熱感染后，各種抗體隨時(shí)間的變化而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化情況，而且為登革熱的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了可能較為有效的登革熱感染的血清學(xué)檢測(cè)方法。
　　 三、為建立登革熱

29、進(jìn)行快速診斷的NS1抗原捕獲膠體金法，我們采用了兩種檢測(cè)分子之間相互作用的免標(biāo)記技術(shù)，RWG和SPR對(duì)DENVNS1單抗與NS1蛋白的親和力進(jìn)行的鑒定與比較。其中，RWG是一種高通量的免標(biāo)記技術(shù)，而SPR可對(duì)分子之間相互作用的動(dòng)力學(xué)信息進(jìn)行詳細(xì)地分析。研究發(fā)現(xiàn)，RWG對(duì)抗原抗體結(jié)合的飽和狀態(tài)下的親和力的篩查，不僅可以檢測(cè)出在SPR中高親和力的抗體，而且還能檢測(cè)出高活性百分?jǐn)?shù)的抗體。而SPR的進(jìn)一步分析提供了抗體的結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)，其中