SDF-1-CXCR4通路在視網(wǎng)膜前體細(xì)胞遷移中作用的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性是視網(wǎng)膜色素變性、老年黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離等常見眼病造成視力損害的原因。移植體外培養(yǎng)的神經(jīng)干/前體細(xì)胞到病變損害的視網(wǎng)膜，取代變性的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，是治療這一類型視網(wǎng)膜病變的有希望的途徑之一。移植的神經(jīng)干/前體細(xì)胞發(fā)揮功能的前提是移植細(xì)胞能夠從移植部位遷移到病變或損傷的部位。譬如，移植到玻璃體腔的神經(jīng)干細(xì)胞必須能夠從玻璃體腔向視網(wǎng)膜內(nèi)遷移，并且穿透視網(wǎng)膜組織的各個(gè)屏障，比如內(nèi)界膜，才有可能到達(dá)病變部位，與視網(wǎng)膜神經(jīng)元建立結(jié)

2、構(gòu)和功能上的聯(lián)系，整合到視網(wǎng)膜神經(jīng)元環(huán)路，進(jìn)而進(jìn)一步分化為成熟神經(jīng)元并發(fā)揮功能。近年來(lái)研究表明，神經(jīng)干/前體細(xì)胞移植到大鼠玻璃體腔或視網(wǎng)膜下腔后，能夠準(zhǔn)確地遷移到遭受病變損傷的部位。GrozdanicSD等把成年海馬回神經(jīng)干/前體細(xì)胞移植到新生或成年大鼠眼玻璃體腔，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞能夠存活一定的時(shí)間并且一部份細(xì)胞能整合到宿主視網(wǎng)膜的板層結(jié)構(gòu)。然而，同時(shí)又發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干/前體細(xì)胞移植到成年動(dòng)物眼內(nèi)時(shí)，只有在視網(wǎng)膜病變或受到損傷時(shí)，才出現(xiàn)廣泛的遷

3、移和整合。這些研究提示，病變或損傷組織可能生成了某些細(xì)胞因子，為外來(lái)的神經(jīng)干前體細(xì)胞遷移到病變部位提供了某種“信號(hào)”，引導(dǎo)供體細(xì)胞向病變組織遷移。但損傷組織產(chǎn)生的這種指導(dǎo)移植細(xì)胞向病變部位遷移的細(xì)胞因子的性質(zhì)是什么目前尚不清楚。 在損傷組織分泌的多種細(xì)胞因子中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromalcells-derivedfactor，SDF-1)目前被認(rèn)為是最有可能引導(dǎo)干細(xì)胞遷移的一個(gè)。SDF-1最先被發(fā)現(xiàn)是白細(xì)胞、造血細(xì)胞及血管

4、內(nèi)皮細(xì)胞的趨化劑，最近的研究發(fā)現(xiàn)SDF-1在調(diào)控胚胎發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)干/前體的遷移以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中也起著至關(guān)重要的作用。為了證明SDF-1-CXCR4功能軸是否參與了指導(dǎo)移植細(xì)胞向受體視網(wǎng)膜病變部位遷移這一過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SDF-1在三種損傷機(jī)理截然不同的視網(wǎng)膜損傷模型中的表達(dá)與時(shí)空分布特點(diǎn)。同時(shí)，為了證明SDF-1發(fā)揮作用的另一基礎(chǔ)，即CXR4(SDF-1的唯一受體)是否存在于供體細(xì)胞，我們檢測(cè)了體外擴(kuò)增的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞上CXCR

5、4的表達(dá)情況，并且檢查SDF-1對(duì)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的體外趨化作用。本研究證實(shí)，視網(wǎng)膜在經(jīng)受各種不同的損傷/病變時(shí)均產(chǎn)生炎癥趨化因子SDF-1，但在不同的損傷模型中有不同的時(shí)空表達(dá)特征。同時(shí)，體外擴(kuò)增的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞表達(dá)SDF-1的受體CXCR4，并且對(duì)SDF-1的趨化反應(yīng)能力呈劑量依賴關(guān)系。這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，SDF-1-CXCR4通路是指導(dǎo)移植細(xì)胞向病變部位遷移的途徑之一。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，視網(wǎng)膜前體細(xì)胞在O2誘導(dǎo)下CXCR4受體表達(dá)增加，提示

6、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植到體內(nèi)后對(duì)SDF-1的趨化能力可能增強(qiáng)。 本研究分為以下四個(gè)部份： 第一部分SDF-1在損傷/病變的視網(wǎng)膜上的表達(dá)研究 目的：探討SDF-1在急性損傷和遺傳性視網(wǎng)膜變性損傷大鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)及時(shí)空分布特征。 方法：60天S-D大鼠37只，隨機(jī)分為缺血再灌注組(16只)、N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)損傷組(16只)、和對(duì)照組(5只)。MNU損

7、傷組腹腔注射MNU60mg/kg體重一次，建立MNU誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜損傷模型。缺血-再灌注損傷組前房110mmHG靜水壓持續(xù)60分鐘建立視網(wǎng)膜急性缺血-再灌注損傷大鼠模型。MNU損傷模型1d，3d、5d和7d后取材，缺血再灌注損傷大鼠再灌注后6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)取材。遺傳性視網(wǎng)膜變性RCS大鼠分為25天和50天組各10只，正常RCS鼠5只作為對(duì)照。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色檢測(cè)不同時(shí)

8、間點(diǎn)模型鼠凋亡細(xì)胞的分布。RT-PCR檢測(cè)以上各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織SDF-1和低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxiainduced-factor，HIF-1)mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SDF1蛋白在視網(wǎng)膜的表達(dá)。 結(jié)果：對(duì)照組未見TUNEL標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞。MNU作用1天后，視網(wǎng)膜外核層出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，3天時(shí)增加最明顯。SDF-1mRNA的表達(dá)量在第3天達(dá)到高峰，SDF-1表達(dá)主要集中在視網(wǎng)膜外核層。視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷12小時(shí)后視網(wǎng)

9、膜內(nèi)層出現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，24小時(shí)數(shù)量最多，SDF-1mRNA的表達(dá)量在24小時(shí)達(dá)到高峰。HIF-1mRNA在損傷后24小時(shí)表達(dá)量最高。SDF-1首先出現(xiàn)在視網(wǎng)膜內(nèi)層小血管周圍，以后在視網(wǎng)膜內(nèi)層擴(kuò)散。25天和50天組RCS鼠視網(wǎng)膜均檢測(cè)到SDF-1mRNA，25天時(shí)表達(dá)高于50天。 結(jié)論：視網(wǎng)膜損傷時(shí)病變組織產(chǎn)生SDF-1，不同類型的損傷SDF-1表達(dá)持續(xù)時(shí)間不同。視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷時(shí)，SDF1表達(dá)可能受低氧誘導(dǎo)因子HI

10、F-1的調(diào)控。 第二部分全神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)法體外擴(kuò)增視網(wǎng)膜前體細(xì)胞 目的：視網(wǎng)膜前體細(xì)胞是視網(wǎng)膜移植的理想供體來(lái)源，本研究的目的是探尋一種既高效又能連續(xù)體外擴(kuò)增視網(wǎng)膜前體細(xì)胞(RetinalProgenitorCells，RPCs)的培養(yǎng)方法。 方法：E17天小鼠胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞采取神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)或直接貼壁培養(yǎng)法。神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)時(shí)，先經(jīng)懸浮培養(yǎng)生成富含前體細(xì)胞的神經(jīng)球，然后將700rmp/min離心分離出的神經(jīng)球接種

11、到Poly-D-Lysine包被的培養(yǎng)瓶，在前體細(xì)胞培養(yǎng)液中(含F(xiàn)GF-2、EGF和LIF)貼壁培養(yǎng)，頭24小時(shí)在培養(yǎng)液中添加10％的胎牛血清。直接貼壁培養(yǎng)法是將細(xì)胞懸液直接接種到預(yù)先包被Poly-D-Lysine的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。撤除前體細(xì)胞培養(yǎng)液中的分裂原，加入10％的胎牛血清和1uM的視黃酸誘導(dǎo)分化7天。細(xì)胞免疫組織化學(xué)和FACS分析神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞特性和分化能力，并與直接貼壁培養(yǎng)法得到的細(xì)胞進(jìn)行比較。 結(jié)果：神經(jīng)球

12、接種到預(yù)先包被Poly-D-Lysine的培養(yǎng)瓶后貼附到培養(yǎng)瓶底，神經(jīng)球周邊的細(xì)胞逐漸向外周延伸，留下扁平的細(xì)胞體，逐漸形成貼壁生長(zhǎng)的單層細(xì)胞。該法能夠在體外長(zhǎng)期擴(kuò)增視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，6個(gè)月內(nèi)細(xì)胞能夠傳代10次以上。在RA誘導(dǎo)分化時(shí)，能夠生成成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞，表達(dá)視網(wǎng)膜細(xì)胞特異性標(biāo)記。FACS分析和免疫組化染色顯示神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)所得細(xì)胞在未分化時(shí)Nestin陽(yáng)性率(92％)細(xì)胞率以及分化為成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞的比率(53.7％)，均高于直接貼壁培

13、養(yǎng)法獲得的細(xì)胞。 結(jié)論：神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)法能夠在體外長(zhǎng)期大量擴(kuò)增視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，能較好地保持干細(xì)胞特性，并容易分化為成熟的視網(wǎng)膜細(xì)胞，較直接貼壁培養(yǎng)具有較大的優(yōu)越性。 第三部分SDF-1對(duì)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的體外趨化作用 目的：分析體外培養(yǎng)的RPC上趨化因子受體CXCR4的表達(dá)以及其配體SDF-1對(duì)RPC的趨化作用。 方法：利用RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)法獲得的RPC上CXCR4受體mRNA的表達(dá)，熒光激活

14、細(xì)胞分類法(Florescent-activatedcellssort，F(xiàn)ACS)測(cè)定CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞率。激光共聚焦顯微鏡檢查CXCR4受體在RPC上的表達(dá)。Boyden小室實(shí)驗(yàn)觀察0ng，40ng，60ng，100ng/ml濃度SDF-1對(duì)RPCs的趨化作用；劃痕試驗(yàn)觀察SDF-1對(duì)RPC增殖和遷移的影響。 結(jié)果：RPC分化前后均表達(dá)CXCR4mRNA，F(xiàn)ACS表明CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占RPC總數(shù)的20％左右。SDF-1對(duì)R

15、PCs的趨化作用在一定范圍內(nèi)隨SDF-1濃度的增加而增加。用Anti-CXCR4抗體封閉RPC上的CXCR4受體，SDF1對(duì)其趨化作用消失。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示SDF-1促進(jìn)RPCs的增殖和遷移。 結(jié)論：體外擴(kuò)增的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞表達(dá)功能性CXCR4受體，SDF-1對(duì)CXCR4陽(yáng)性RPC有趨化作用，趨化效率與SDF-1濃度呈劑量依賴關(guān)系。 第四部分缺氧誘導(dǎo)增加視網(wǎng)膜前體細(xì)胞表達(dá)CXCR4受體 目的：CXCR4及其配體SDF

16、-1組成的趨化軸在指導(dǎo)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞向病變部位定向遷移的過(guò)程中可能起重要作用。增加RPC的CXCR4的表達(dá)率有可能增強(qiáng)干細(xì)胞的趨化活性，從而提高移植細(xì)胞的定向遷移能力?？紤]到干細(xì)胞移植到玻璃體腔或視網(wǎng)膜下腔后面臨的O2濃度遠(yuǎn)低于體外培養(yǎng)環(huán)境，因此本文探討RPC在低氧培養(yǎng)時(shí)CXCR4受體表達(dá)情況。 方法：FACS檢測(cè)10％O2濃度培養(yǎng)24，36h和48h小時(shí)后，RPC中CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞百分比，RT-PCR檢測(cè)CXCR4和HIF-

17、1和mRNA的表達(dá)。Boyden小室實(shí)驗(yàn)觀察60ng/ml的SDF-1對(duì)低氧培養(yǎng)不同時(shí)間的RPC的趨化效率。 結(jié)果：FACS檢測(cè)表明，低O2培養(yǎng)24，36h和48h小時(shí)后RPC中CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞率分別為19.6％、26.9％和46.1％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性。在正常O2培養(yǎng)時(shí)未能檢測(cè)到HIF-1mRNA的表達(dá)，但低O2培養(yǎng)后HIF-1mRNA表達(dá)逐漸升高。Boyden小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)60ng/ml的SDF-1對(duì)低氧培養(yǎng)不同時(shí)間的