照射前后不同放射敏感性鼻咽癌細(xì)胞CNE1和CNE2中DNA-PK活性與核內(nèi)表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究.pdf

1、[目的] 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是一種發(fā)病極具地域特色的惡性腫瘤，由于輻射抗拒導(dǎo)致腫瘤局部未控或復(fù)發(fā)是放射治療失敗的主要原因之一。故研究鼻咽癌細(xì)胞輻射抗拒機(jī)制，尋找敏感的預(yù)測(cè)指標(biāo)精確評(píng)估疾病及逆轉(zhuǎn)放射抗拒是提高鼻咽癌5年生存率和改善生活質(zhì)量的重要一環(huán)。本項(xiàng)目主要是以DNA-PK為切入點(diǎn)來(lái)探討鼻咽癌的放射敏感性。 [研究方法] 1、電鏡觀察鼻咽癌細(xì)胞株CNE1(鼻咽高分化

2、鱗癌細(xì)胞)和CNE2(鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞)分化情況；生長(zhǎng)曲線法求出兩株細(xì)胞的倍增時(shí)間，比較增殖差異：集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定CNE1和CNE2不同劑量下的存活分?jǐn)?shù)，分別用線性二次模型和單擊多靶模型擬合劑量存活曲線并求出放射生物學(xué)參數(shù)α、β、2Gy存活分?jǐn)?shù)(SF2)和D<,0>、D<,q>、N以評(píng)價(jià)兩株細(xì)胞的放射敏感性差異。 2、Signa TECT DNA-Dependent Protein Kinase Assay System試劑盒

3、檢測(cè)4Gy照射前后不同時(shí)間CNE1、CNE2中DNA-PK的活性變化差異。 3、激光共聚焦檢測(cè)不同放射敏感性鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、CNE2細(xì)胞中4Gy照射前后Ku70、Ku80、DNA-PKcs在細(xì)胞中的定位改變，探討照射能否引起DNA-PK在這兩株細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)運(yùn)。 4、Westem blot檢測(cè)照射前后Ku70、Ku80在不同放射敏感性鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、CNE2細(xì)胞中的核內(nèi)表達(dá)差異，用scion軟件分析蛋白條帶的光

4、密度值作半定量分析。 [研究結(jié)果] 1、電鏡下：CNE2細(xì)胞呈圓或橢圓形，細(xì)胞核漿比例大，細(xì)胞核大而不規(guī)則，可見多個(gè)大核仁；胞漿少量，細(xì)胞器較少，可見大量核糖體及糖蛋白，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體少見，細(xì)胞呈低分化至未分化形態(tài)。CNE1細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞膜間可見細(xì)胞間連接，但未見典型橋粒，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見張力原纖維；細(xì)胞核漿比例較小，細(xì)胞核仁小，異染色質(zhì)豐富，胞漿內(nèi)可見大量核糖體、線粒體也較多，細(xì)胞相對(duì)于CNE2細(xì)胞相對(duì)分化較好。

5、 2、CNE2增殖比CNE1快，CNE1細(xì)胞接種后經(jīng)過一天的滯留期，從第2天開始到第6天為其指數(shù)生長(zhǎng)期，之后緩慢進(jìn)入平臺(tái)期；CNE2細(xì)胞接種后經(jīng)過短暫的滯留期后迅速進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，至第5天細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰，之后進(jìn)入平臺(tái)期。CNE1、CNE2的倍增時(shí)間分別為21.53h、18.08h，(p>0.05)。 3、CNE1存活曲線明顯比CNE2平坦，CNE1各個(gè)劑量點(diǎn)的存活分?jǐn)?shù)均比CNE2高，線性部分的α比CNE2小(0.323 VS

6、0.704)，D比CNE2大(0.1 VS 0.058)，SF2 CNE1大于CNE2(0.39 VS 0.11)，CNE1、CNE2的D<,0>分別為1.4413和0.4430，D<,q>分別為0.8285和0.6744。即CNE2細(xì)胞的內(nèi)在放射敏感性顯著高于CNE1細(xì)胞。 4、DNA-PK的活性檢測(cè)結(jié)果：CNE1細(xì)胞中各個(gè)蛋白濃度的DNA-PK的活性均高于CNE2細(xì)胞：當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?5ug-200ugR寸，DNA-PK活性隨

7、著蛋白量的增多呈線性上升。取樣25ug時(shí)，放射較為抗拒的CNE1細(xì)胞中DNA-PK活性較放射敏感的CNE2細(xì)胞明顯高(4.137±0.688 VS 0.412±0.128，p<0.05)；4Gy照射后1h～24h，DNA-PK活性均有提高，且CNE1細(xì)胞中DNA-PK活性始終較CNE2細(xì)胞高。 5、激光共聚焦顯微鏡觀察：鼻咽癌細(xì)胞株CNE1/CNE2細(xì)胞中，照射前DNA-PKcs、Ku70、Ku80細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有表達(dá)，但主要

8、定位于細(xì)胞核；4Gv照射可引起DNA-PK蛋白在CNE1/CNE2中發(fā)生明顯的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，照射后15min核內(nèi)蛋白表達(dá)即有增強(qiáng)，至照射后1-6h核內(nèi)表達(dá)最強(qiáng)，12h-24h開始減弱，但還是強(qiáng)表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)。 6、Western blot結(jié)果顯示：Ku70、Ku80在放射敏感性不同的鼻咽癌細(xì)胞CNE1/CNE2均有表達(dá)且表達(dá)很強(qiáng)，比較兩株細(xì)胞總蛋白中Ku的基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)顯著性差異：4Gy照射后蛋白表達(dá)水平也無(wú)明顯變化。Ku70、Ku80

9、蛋白在細(xì)胞漿蛋白中表達(dá)在兩株細(xì)胞中比較無(wú)顯著性差異，而在同一株細(xì)胞中，4Gy照射后較照射前明顯減弱，上樣15ug檢測(cè)照射后1h后～24h細(xì)胞漿中只有微弱Ku蛋白表達(dá)： 在細(xì)胞核蛋白中，Ku蛋白表達(dá)水平4Gy照射后1h開始較照射前則明顯增強(qiáng)，而在兩株細(xì)胞中比較也無(wú)顯著性差異。 [結(jié)論] 1、CNE1細(xì)胞分化較高，CNE2細(xì)胞呈極低分化形態(tài)；CNE2細(xì)胞的內(nèi)在放射敏感性顯著高于CNE1細(xì)胞。 2、CNE1細(xì)